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胰腺癌恶性程度高,是治疗效果较差的恶性肿瘤之一,而且其发病率有逐年升高趋势。胰腺癌在欧美居常见恶性肿瘤的第4位,在我国位于恶性肿瘤死亡的第9位。据报道胰腺癌在初次确诊后,1年内死亡率达80%, 3年内为95%。转移患者的中位生存时间3-6 mo,局部晚期6-10 mo。早期诊断早期治疗是胰腺癌治疗效果较前略有提升的重要原因。手术技术的进步并未明显改善患者的预后。目前认为在手术同时配合化疗及其他综合治疗才能达到提高生活质量和延长生存时间的目的。吉西他滨目前仍是治疗胰腺癌的首选药物,但吉西他滨与其他药物的联合尚无统一的标准方案。胰腺癌的化疗效果仍不是很理想,虽吉西他滨对胰腺癌效果较确切,但有效率仅为25%。多药耐药(multidrugresistance,MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因之一。MDR机制却不明确,研究表明胰腺癌吉西他滨耐药与P53和Aurora等的表达异常有关,具体机制尚待研究。与化疗药物毒副反应大的特点相比,中草药具有独特的优势。随着对中草药研究的不断深入,发现了许多具有抗肿瘤作用的中草药。苦参是一味传统中药,现代医学表明,苦参类生物碱不仅具有较高的抗肿瘤活性及免疫调节作用,近来研究表明还具有逆转肿瘤对化疗药物耐药的作用。为了评价苦参碱对胰腺癌的抗肿瘤作用,探究Aurora-A表达与胰腺癌吉西他滨耐药的关系,明确苦参碱是否具有逆转胰腺癌吉西他滨耐药及调节Aurora-A的作用,本课题分以下三个部分进行了研究:第一部分体内外循环筛选法构建新型的胰腺癌吉西他滨耐药模型目的:构建新型的更接近疾病规律的胰腺癌吉西他滨耐药细胞及动物模型。方法:选择胰腺癌细胞株PANC-1通过体外细胞培养,裸鼠皮下成瘤后瘤块移植构建胰腺癌动物模型,腹腔吉西他滨化疗,选取瘤体最大的动物模型,获取瘤块,进行分离提取瘤体细胞进行培养,用于下一循环的动物模型构建,如此循环两次,获得耐药细胞株及动物模型。将原代细胞和耐药细胞分别进行体外及体内吉西他滨的耐药试验,分析验证耐药模型。通过微卫星序列测定鉴定耐药模型与亲代细胞的同源性。结果:建立了胰腺癌吉西他滨耐药的细胞及动物模型,第一循环原位移植成功率为73.3% (11/15),吉西他滨腹腔灌注后死亡率为18.2% (2/11),瘤体最大的5个均值为1.76±0.87g,远处转移率11.1% (1/9);第二循环原位移植成功率80% (12/15),吉西他滨腹腔灌注后死亡率为8. 3% (1/12),瘤体最大的5个均值为2.16±1.12g,远处转移率36.3% (4/11)。;两循环比较,瘤体大小及远处转移率具有统计学差异(P<0. 05)。将第2循环后培养的胰腺癌吉西他滨耐药命名为PANC-1/R2。在5ug/dl、10ug/dl和20ug/dl浓度的吉西他滨作用下PANC-1和PANC-1/R2的抑制率分别是21.8%、37.1%、46.1%和12.6%、25.3%、36.8%。PANC-1和PANC-1/R2裸鼠皮下移植后3周成瘤,吉西他滨240mg/kg腹腔注射1周/次*4次,35天后瘤体大小分别是1.87±0.69g和2.09±0.71g,差别具有统计学意义(P<0.05)。人类基因组微卫星D14568、D18569、D205199检测结果显示,亲代胰腺癌细胞、吉西他滨耐药胰腺癌细胞三个位点微卫星扩增大小完全相同的片段,而荷瘤裸鼠胰腺组织没有扩增出相应的带型。结论:运用体外细胞培养,体内化疗药物诱导的方法是可行的,该体系可用于各种耐药细胞的筛选,与原代细胞相比,筛选后的细胞明显耐药性增强。而且构建的细胞株更符合机体多因素复杂环境下的耐药产生过程,是理想的耐药模型。并且该方法构建的耐药细胞与亲代细胞具有相同的遗传位点,具有遗传同源性。但构建过程长,需要熟练和细致的操作,提高成功率,增加循环次数或可筛选更具耐药特性的细胞模型。第二部分Aurora-A的表达差异与胰腺癌吉西他滨耐药及转移率、转移方式的关系目的:探讨Aurora-A的表达与胰腺癌吉西他滨耐药之间的关系及与转移率、转移方式的关系。方法:qPCR法测定PANC-1和PANC-1/R2细胞株Aurora-A mRNA的表达,进行对比分析;分别用PANC-1和PANC-1/R2建立皮下移植瘤模型,原位移植构建胰腺癌动物模型,免疫组化方法测定瘤体Aurora-A的表达,并分析Aurora-A表达阳性率与瘤体转移率和转移方式的关系。结果:PANC-1组模型第5周肿瘤转移率为36. 8% (7/19),其中淋巴结转移,腹膜播散,肝脏转移,肠道转移的发生率依次为36. 8% (7/19), 15. 8% (3/19), 10. 5% (2/19),5.3%(1/19),裸鼠体重23.2±1.41g,肿瘤重量0.453±0.110g;PANC-1/R2组模型第5周肿瘤转移率为50% (9/18),其中淋巴结转移,腹膜播散,肝脏转移,肠道转移的发生率依次为 50% (9/18),33.3% (6/18),22.2% (4/18) , 11.1% (2/18),裸鼠体重22.91.±1.13g,肿瘤重量0.564±0.203g。转移率和肿瘤质量两者具有明显差别。PANC-1 组 Aurora-A mRNA 表达是 1.002±0.040; PANC-1/R2 组 Aurora-A mRNA 是1.845±0.069,两组比较表达明显差异(P<0.05)。PANC-1/R2组18例标本组织中Aurora-A蛋白阳性表达15例(83. 3%); PANC-1组19例组织的Aurora-A蛋白检测阳性表达11例(57. 9%),两组相比差异有显著统计意义(P<0. 05)。PANC-1组Aurora-A的阳性表达同总转移率、淋巴转移、肝脏及肠道转移均明显相关(P<0.05), PANC-1/R2组Aurora-A的阳性表达与转移率无关(P>0.05)。结论:Aurora-A基因高表达与胰腺癌细胞株的吉西他滨耐药有关,新方法构建的PANC-1/R2耐药株Aurora-A基因高表达,可用于胰腺癌吉西他滨耐药研究的载体。在体研究也表明Aurora-A的表达差异与胰腺癌吉西他滨的耐药相关,但与转移率及转移方式无明显关系。第三部分苦参碱诱导胰腺癌细胞凋亡和逆转胰腺癌吉西他滨耐药作用及对Aurora-A表达的影响目的:评价苦参碱对胰腺癌细胞诱导凋亡作用,明确苦参碱是否具有调节Aurora-A作用及逆转胰腺癌吉西他滨耐药作用。方法:MTT法检测不同浓度苦参碱对PANC-1细胞株的细胞毒性,选择安全范围浓度,测定不同浓度苦参碱联合吉西他滨作用下PANC-1, PANC-1/R1和PANC-1/R2三株细胞的抑制率,流式细胞技术测定苦参碱和吉西他滨不同给药方式下细胞凋亡的情况;qPCR检测PANC-1/和PANC-1/R2在苦参碱、吉西他滨及苦参碱联合吉西他滨作用下Aurora-A基因的表达,明确苦参碱与Aurora-A表达的关系。结果:苦参碱随着浓度的升高细胞毒性越明显,但2-64 ug/ml之间生长率变化不大,其浓度依赖的细胞毒作用并不显著。苦参碱浓度在32ug/ml时,在吉西他滨0-40ul作用下,各组的抑制率均有所增加(P<0.05),64ug/ml时各组抑制率较32ug/ml时无明显变化(P>0.05)。在相同浓度作用下,PANC-1、PANC-1/R1和PANC-1/R2的抑制率呈递减趋势。流式细胞技术显示苦参碱和吉西他滨不同给药方式在PANC-1组和合PANC-1/R2组内凋亡率无明显差异,但两组间差异明显。qPCR技术检测PANC-1和PANC-1/R2细胞株Aurora-A mRNA表达,同样发现组内各种处理下Aurora-A mRNA表达无明显差异,但组间表达明显差异。结论:苦参碱与吉西他滨联合作用具有诱导胰腺癌细胞凋亡的抗肿瘤作用,但不能逆转胰腺癌吉西他滨耐药的作用,不能增加化疗敏感性,也不具有调节Aurora-A表达的作用。提示苦参碱可通过诱导凋亡途径发挥抗胰腺癌作用,但其作用不十分显著。