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金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称金葡菌）是一种常见的革兰氏阳性病原菌，侵入机体后能够引起人或动物肺炎、心内膜炎、败血症、奶牛乳腺炎等多种感染性疾病的发生，严重时可以造成患病人畜死亡。在感染发生的第一时间，宿主天然免疫系统对病原菌的快速识别提供了感染防御的第一道防线。这个识别的过程是通过一系列模式识别受体（PRRs），如TLRs介导进行的。到目前为止，在哺乳动物中共发现了13种TLRs，通常称为TLR1-TLR13。作为一种I型跨膜蛋白，TLRs在多种免疫细胞及非免疫细胞中均有表达。其中，TLR2被认为在宿主识别金葡菌的过程中发挥了重要的作用。早期的研究认为，在来源于金葡菌的表面成份中，脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖（PGN）可以作为配体在免疫细胞中被TLR2所识别，并通过MyD88依赖性信号转导通路诱导细胞因子和趋化因子的产生。然而，越来越多的证据表明是脂蛋白，而不是LTA或PGN，可作为金葡菌被TLR2识别并激活免疫细胞的主要免疫活性成份。研究证实，TLR2与TLR1或TLR6以形成异源二聚体复合物的形式参与对金葡菌脂蛋白的识别，进而诱导免疫细胞的激活，但是否有其它TLRs也参与这个过程还是未知的。本实验的目的是探讨除已知的TLR2外，是否有其它TLR家族蛋白也参与了宿主对金葡菌的天然免疫应答，以及它们在这个过程中究竟起到何种作用。除金葡菌脂蛋白，研究证实TLR2也负责识别来源于其它病原体，如结核分枝杆菌、螺旋体、支原体的脂蛋白。近期Blumenthal等人报道，小鼠巨噬细胞对结核分枝杆菌19kDa脂蛋白的识别不仅仅依赖于TLR2，另一种TLR家族蛋白RP105也参与了这个过程。在小鼠巨噬细胞中，RP105可以优化并协同TLR2对结核分枝杆菌19kDa脂蛋白的应答，进而诱导巨噬细胞释放细胞因子和趋化因子。与结核分枝杆菌类似的是，脂蛋白也是金葡菌通过TLR2信号转导通路激活免疫细胞的主要免疫活性成份。所以RP105很可能也参与了巨噬细胞对金葡菌的天然免疫应答。研究证实在抗原递呈细胞如树突细胞和巨噬细胞中，RP105/MD-1复合物能够与TLR4/MD-2复合物发生生理性结合，抑制TLR4介导的促炎性细胞因子释放。同时，在B细胞中，RP105可以优化TLR4介导的脂多糖（LPS）识别。所以在免疫细胞中，RP105与TLR4之间在功能上具有紧密的联系。因此在本研究中，验证TLR4是否参与宿主巨噬细胞被金葡菌激活的过程也是非常必要的。本实验使用金葡菌SA113（ATCC35556）野生株（WT）、SA113lgt::ermB（Δlgt）脂蛋白表达缺陷株和SA113lgt::ermB+pRBlgt（+pRB）脂蛋白表达回复株分别感染小鼠腹腔巨噬细胞。实验数据表明，与其它两株金葡菌相比，金葡菌脂蛋白表达缺陷株无法诱导小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子及趋化因子的大量释放，同时对小鼠巨噬细胞IκB-α-NFκB及MAPK信号转导通路的激活程度明显较低。这个结果说明，当脂蛋白表达缺失时，小鼠巨噬细胞对金葡菌不能进行正常识别，导致后续的免疫学效应无法产生。同时实验结果表明，金葡菌脂蛋白的缺失对巨噬细胞表面共刺激分子CD80及CD86的表达没有显著影响。这说明金葡菌脂蛋白可能主要通过TLRs介导的信号转导通路促进巨噬细胞的激活，而与细胞表面共刺激分子的表达不具有直接联系。实验数据表明，巨噬细胞被金葡菌感染后，TLR2、TLR4、RP105及MD-1在细胞表面的表达均出现显著上升。同时实验结果显示，TLR2基因的表达显著上升，但TLR4、RP105及MD-1基因的表达显著下降。这个结果与TLR4、RP105及MD-1的膜表达是无法对应的。为了解释这个现象，本文对TLR4及RP105蛋白在细胞总蛋白中的表达进行了检测。结果显示，在金葡菌感染后，巨噬细胞总蛋白中TLR4及RP105的表达均出现显著下降，这与基因表达的结果是相符合的。这个结果说明，金葡菌的感染可能改变了巨噬细胞TLR4、RP105及MD-1蛋白膜转运的效率。同时实验数据显示，在金葡菌感染巨噬细胞的过程中，TLR2、TLR4及RP105之间均可形成异源二聚体复合物。这可能是三者在宿主天然免疫系统抵御金葡菌感染的过程中发挥作用的重要形式。通过对巨噬细胞表面TLR2、TLR4及RP105功能的抑制，本文发现三者在金葡菌感染巨噬细胞后细胞因子的释放及IκB-α-NFκB、MAPK信号转导通路的激活中均发挥了各自的作用，说明在金葡菌感染的过程中，TLR2、TLR4及RP105均参与了巨噬细胞的激活。为了深入讨论上述结果，本文通过进一步的实验观察RP105对TLR2及TLR4介导的信号转导的影响。本实验使用TLR4配体LPS或TLR2配体Pam3CSK4刺激小鼠巨噬细胞，实验结果显示，RP105对LPS诱导的NFκB p65入核及巨噬细胞促炎性细胞因子释放具有抑制作用，而对Pam3CSK4诱导的NFκB p65入核及促炎性细胞因子释放没有影响。同时结果显示，LPS和Pam3CSK4诱导的巨噬细胞抗炎性细胞因子和趋化因子释放均依赖于RP105的功能，提示与其它TLRs类似，RP105可能也具有相应的信号转导通路存在。综上所述，本实验证实了除TLR2外，TLR4及其同源蛋白RP105也参与了巨噬细胞对金葡菌感染的天然免疫应答，并在这个过程中发挥了重要的作用。同时本文证实RP105的功能不仅局限于对TLR4介导的信号转导进行调节，说明RP105在宿主天然免疫防御病原体入侵的过程中很可能也占有重要的地位。本课题组将在未来的实验工作中进一步证实这个观点。