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DNA是生物体遗传物质及基因信息表达、存储和传递的载体。生物体受到的大多数辐射损伤与DNA在分子水平上的物理的、化学的变化有重要关系。生物体系中的DNA和其他生物大分子一直持续暴露在内源性活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)中,这些活性氧自由基会对DNA造成氧化损伤。除了内源性的活性氧自由基外,外源性的化学物质(如卤素,烷基化试剂,过渡金属等)和物理因素(如电离辐射,紫外线照射等)也会造成DNA的氧化损伤,进一步导致细胞的癌变、衰老甚至死亡。因此,DNA氧化损伤所涉及的化学反应机理具有重要的基础研究价值。 DNA氧化损伤涉及的化学反应机理非常复杂,反应过程中生成的各种瞬态中间体往往具有很高的反应活性。对这些决定反应进程的关键短寿命的瞬态物种进行结构和动力学的实验研究,可为揭示反应机理和特性提供直接信息。本论文采用时间分辨紫外-可见吸收光谱技术,并结合量子化学计算,探测并表征了常规DNA和硫代磷酸化修饰DNA(S-DNA)分别与氧化性自由基反应路径中的瞬态反应中间体,揭示了自由基离子对、双中心三电子自由基、以及单电子氧化和脱质子反应等导致DNA氧化损伤的分子基元反应机理。 本研究工作主要包括捕捉DNA鸟嘌呤氧化损伤反应的自由基离子对中间体、硫代DNA氧化损伤反应的双中心三电子自由基中间体研究和DNA单电子氧化阳离子自由基的脱质子反应机理三个部分: 一、捕捉DNA鸟嘌呤氧化损伤反应的自由基离子对中间体 自由基离子对是DNA氧化损伤反应及光致电子转移反应中一类关键的瞬态反应中间体,虽然在以往的研究中经常提出这种可能的关键反应中间体,但由于自由基离子对中间体寿命很短(~ps)而且稳定性极低,实验一直难以探测到。我们通过低温稳定反应中间体的方法并结合时间分辨紫外-可见吸收光谱探测,成功捕捉到了DNA鸟嘌呤氧化损伤基元反应途径中的自由基离子对中间体。对于氯自由基与G碱基的反应体系,在低温瞬态吸收光谱上探测到中心位于570nm的强吸收峰,结合理论计算归属为G+·…Cl-离子对中间体,我们发现这一可见光区域的特征吸收光谱是由离子对静电作用改变跃迁轨道空间重叠所致,与G+·本身在可见区吸收弱的光谱行为有明显区别。进一步在双链DNA的氧化反应体系中,观测到离子对中间体在570nm的特征光谱裂分为480nm和610nm两个吸收峰。借助动力学分析,确定了这两个吸收峰对应于双链GC碱基对内质子转移平衡的两种离子对结构Cl-…G+·:C(→)Cl-…G(-H)·:C(+H+),通过离子对特征光谱的裂分,可以清晰区分双链DNA碱基对内质子转移平衡的两种质子化结构,并测得质子转移的反应能垒(1.4-1.7kcal/mol)。这些结果给出DNA鸟嘌呤氧化反应的自由基离子对机理的关键实验证据,可帮助深入认识DNA质子耦合电子转移和DNA氧化损伤等过程的反应机理。 二、硫代DNA氧化损伤反应的双中心三电子自由基中间体研究 S-DNA可在细菌等生命体中天然存在,由于具有防止人体内核酸酶降解的功能而有非常广泛的药物应用,但S-DNA氧化损伤的分子基元反应机理仍不清楚,反应动力学机制仍然缺乏。基于S-DNA在生物学上的重要意义,我们通过时间分辨紫外-可见吸收光谱技术结合量子化学计算,开展了S-DNA氧化损伤反应的瞬态中间体及其分子基元反应动力学机理的研究。我们研究了S-DNA分别与氧化性自由基SO4-·,Cl2-·,Br2-·,OH·的反应,在瞬态紫外-可见吸收光谱上捕捉到了两种含有双中心三电子自由基的中间体-P-S∴S-P-(410nm)和-P-S∴Br(380nm),通过TDDFT计算进一步确认了这些瞬态物种的归属,并借助费米黄金规则给出了这类双中心三电子自由基特征光谱的理论解释。动力学及氧化还原电势分析表明硫代磷酸骨架是一个潜在的氧化位点,可在氧化物种进攻S-DNA时与G或A形成竞争反应。这些结果表明,当硫代磷酸作为基因治疗应用引入到DNA骨架时,其化学稳定性如抗氧化能力需要重新评估。进一步,通过瞬态光谱我们观测到了空穴直接从碱基A+·/A(-H)·转移至硫代磷酸骨架上的动力学过程,这与常规DNA空穴转移方向明显不同,表明磷酸骨架也可以作为一个潜在的修饰位点来参与DNA电子传输器件的设计。 三、DNA单电子氧化阳离子自由基的脱质子反应机理 DNA碱基中氧化还原性质活泼的鸟嘌呤G或腺嘌呤A发生单电子氧化反应后,会形成表现酸性的G+·或A+·。G+·或A+·在中性溶液中可发生脱质子反应从而引发后续的DNA氧化损伤。为了从分子层次上阐明G+·和A+·脱质子反应机理,我们进行了瞬态吸收光谱实验结合量子化学计算的研究: 对于G碱基:G+·存在N1-H和N2-H两个可能脱质子位点,我们首先建立含有不同水分子个数参与的G+·脱质子的模型,计算得到脱N1-H质子势垒。通过不同温度下测得的G+·脱N1-H质子反应速率常数,进行阿伦尼乌斯公式拟合得到了G+·脱N1-H质子反应活化能(15.1kJ/mol)。通过分析对比显性水分子的个数与位置对该过程势垒的影响,推断含有第一层第二层显性水分子参与的4H2O-PCM模型最适合描述G+·的脱N1-H质子过程。在此基础上,我们进一步建立了G+·脱N2-H质子的反应模型,得到了G+·脱N2-H质子反应的活化能(19.9kJ/mol)。这些结果进一步说明碱基G+·更易发生脱N1-H质子的基元途径,并且水团簇离子(H9O4+)在脱质子过程中起到重要作用。 对于A碱基:以往研究多聚焦在G+·,A+·后续反应如脱质子过程的研究相对匮乏:不仅A+·在双链中脱质子路径存有争议,而且A+·单体脱质子动力学的数据也不全面。我们通过测量脱质子产物A(N6-H)·的生成速率常数与A的浓度依赖关系,得到A+·脱N6-H的速率常数为2.0×107s-1。进一步测量脱质子速率常数与温度的关系,获得A+·脱N6-H的活化能为17.1kJ/mol(4.1kcal/mol)。另外,我们采用考虑显性水分子和PCM溶剂化模型下的DFT理论方法计算了碱基单体及DNA双链中A+·脱质子的反应路径,与实验测量的反应能垒比较,确定了A+·在DNA双链中的脱质子路径与碱基单体相同,都是直接脱去N6-H质子,而不发生AT碱基对内的质子转移过程。这些结果解决了以往研究的困惑,有助于深入理解DNA碱基的氧化损伤过程和DNA电荷传导方面的应用。