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研究背景:腹膜纤维化迄今仍然是一个世界性的难题,是导致尿毒症患者被迫中断长期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的最主要因素,目前尚无有效的治疗方法。在非生理性腹膜透析液的长期刺激下,就会导致腹膜纤维化的发生,其重要机理是腹膜间皮细胞从上皮细胞表型向肌纤维母细胞的转分化,即上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)过程的发生,由此启动细胞增殖和胶原等基质的积聚等,主要信号转导涉及到TGF-β-Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR途径等。雷帕霉素(rapmycin),通过与FK结合蛋白(FK-binding protein,FKBP)结合,抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性,进而抑制细胞生长与增殖。在肾、肝、心等多个脏器领域的研究中雷帕霉素在抗增殖和抗纤维化方面已经显示了重要作用。而雷帕霉素在防治腹膜纤维化方面的报道非常少且机制仍未阐明。Rho GTPases作为Ras超家族的一个亚族,通过调节细胞骨架的重构及基因转录,调控了大量如细胞极化、细胞的黏附及迁移、分化、增殖等的细胞活动。其中研究的最多的三个成员是RhoA、Rac1和Cdc42。研究表明,Rho GTPases在EMT过程中起到了至关重要的作用。此外,研究证实,mTOR与Rho GTPases之间的信号交互作用,参与介导了多种细胞EMT及纤维化病变的发生过程;而雷帕霉素通过阻断mTOR的表达抑制部分Rho GTPase的活性,进而抑制EMT。目前mTOR与Rho GTPases在腹膜纤维化中作用的研究尚未见报道。基于以上分析,我们认为雷帕霉素可能通过调节Rho GTPases的活性抑制腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化的过程。为此,本研究开展如下。第一部分雷帕霉素有效抑制腹膜透析大鼠腹膜纤维化研究目的:明确雷帕霉素对于腹膜透析模型大鼠腹膜纤维化的防治效果实验方法:取45只正常SD大鼠,随机分为5组:正常组,生理盐水组,高糖组,低浓度雷帕治疗组,高浓度雷帕治疗组,处理6周后处死,评估腹膜功能,取腹膜组织,行HE染色及α-肌动蛋白(smooth muscle actin-alpha,α-SMA)及转化生长因子-βI(transforminggrowth factorβ1,TGF-β1)的免疫组化染色,分析各组腹膜纤维化情况,Western Blot及realtime PCR检测α-SMA、TGF-β1的表达变化。结果:高糖组大鼠的腹膜功能相较正常组及生理盐水组明显下降,低浓度雷帕及高浓度雷帕均显著改善腹膜功能;HE染色显示,高糖组呈现腹膜纤维化状态,腹膜厚度明显增加,低浓度雷帕及高浓度雷帕均显著改善腹膜纤维化状态,且呈浓度相关性。免疫组化、Western BIot及realtime PCR显示,高塘组α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表达较对照组明显升高,雷帕组表达明显下降,且呈浓度相关性。结论:通过动物层面验证了雷帕霉素对腹膜纤维化有明显的防治作用,在有效浓度范围内,其防治效果与剂量呈一定的正相关。雷帕霉素减少TGF-β的分泌,抑制成纤维细胞的形成,抑制细胞外基质形成。第二部分雷帕霉素抑制高糖诱导腹膜间皮细胞EMT的研究研究目的:明确雷帕霉素对于腹膜间皮细胞EMT的抑制作用实验方法:取正常SD大鼠腹膜,原代培养腹膜间皮细胞,取第3-4代细胞,予以不同浓度高糖(30,60,120mM)干预,及不同浓度雷帕霉素(10,100nM)干预一定时间,通过Western Blot检测细胞中α-SMA及E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,通过realtimePCR检测α-SMA、纤维连接蛋白(Fibronectin)及胶原蛋白I(Collagen-I)的表达;细胞划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移能力的变化。结果:高糖处理后,α-SMA、Fibronectin、CollagenI的表达量相较正常组明显升高,E-cadherin的表达量明显下降,细胞迁移能力明显增加。与高塘组相比,雷帕霉素使α-SMA、Fibronectin、Collagen I的表达明显下降,E-cadherin的表达明显升高,细胞迁移能力明显下降,且呈浓度相关性。结论:高糖处理后腹膜间皮细胞呈现EMT改变,雷帕霉素有效抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT。第三部分雷帕霉素通过抑制Rho GTPases的活性逆转腹膜间皮细胞EMT研究目的:探索雷帕霉素抑制腹膜间皮细胞EMT的具体作用机制实验方法:取原代培养腹膜间皮细胞,予以不同浓度高糖(30,60,120mM)干预,及不同浓度雷帕霉素(l0,l00nM)干预一定时间,通过Western Blot检测细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate3-kinase,PI3K)的、p-PI3K、蛋白激酶 B(PKB 或 Akt)、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达;通过pull down方法检测GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc2蛋白的表达;通过细胞免疫荧光方法观察细胞骨架的变化情况。结果:高糖处理后,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达量相较正常组明显升高,雷帕霉素明显减少p-mTOR的表达量;Pull down实验显示,RhoA、Rac1及Cdc42的GTP活化水平在高糖刺激后明显升高,雷帕霉素使三者的GTP水平明显下降;细胞免疫荧光实验显示,正常的腹膜间皮细胞呈现少量的应力纤维(stress fiber)、粘着斑(focal adhesion)、板状伪足(lamellipodia)、丝状伪足(filopodia),高糖刺激使得腹膜间皮细胞形成更多的 stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia,而雷帕霉素明显减少这些细胞骨架结构的形成,使其恢复至接近正常细胞的骨架结构。结论:高糖激活腹膜间皮细胞PI3K/Akt/mTOR通路的激活;Rho GTPases通过调节 stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia进而影响腹膜间皮细胞的 EMT,雷帕霉素通过抑制Rho GTPases的活化逆转高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT。