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纸浆漂白是工业造纸流程的必经环节。纸浆中的残余木质素需经多步漂白工序予以脱除以提高最终成纸的白度。生物漂白是一种纸浆漂白新技术,因采用酶来替代有毒污染的含氯化学漂白剂,对环境友好,因此成为当前研究的热点。酶的热稳定性及对各种理化失活因素的抗性对工业酶催化至关重要,在工业漂白过程中使用嗜热酶具有诸多优势:例如,更好的健壮性;当提高反应温度时,酶的催化效率更高,从而获得更好的漂白处理效果,缩短处理时间,甚至节约酶的使用量等。到目前为止,关于研究开发真菌来源的木质素降解酶的相关报道较多,相比之下,将原核生物来源的嗜热酶应用于纸浆漂白方面的研究报道则非常稀少。从极端嗜热细菌中寻找热稳定性更好的酶,给基于酶的漂白技术在造纸工业领域的应用突破带来了新的思路。极端嗜热细菌嗜热栖热菌Thermus thermophilus HB27和海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8是富有应用价值的嗜热酶的重要来源,本文的主要研究内容为:1.T.thermophilus HB27菌株基因组中包含耐热性胞内漆酶的编码基因。以p Hsh热激表达载体为基础,通过设计一种简单的选择性密码子优化策略,提升该耐热性漆酶Tth-laccase成熟肽编码序列在大肠杆菌宿主体内的表达水平。通过使用定点突变技术对该酶成熟肽编码序列N端(Gln2–Val84)及中部富含GC区域(Gly278–Pro303)进行密码子偏好性优化,使酶基因在热激诱导表达后,细胞上清中漆酶活力从未优化前的20.7±1.5 U/L提升到1790.2±81.6 U/L,提高了86倍。这是首次采用p Hsh大肠杆菌表达系统实现该酶基因在大肠杆菌宿主中的高效表达。2.在发现Cu2+是重组Tth-laccase全酶(holoenzyme)耐热性的关键之基础上,利用全酶分子(holoenzyme)极强的热稳定性,摸索出一种简单快捷的重组酶纯化方法:酶基因热激诱导表达结束后,首先将细胞上清中的重组Tth-laccase脱辅基酶分子(apoenzyme)和Cu2+结合形成全酶分子(holoenzyme),然后直接将细胞上清液置于85°C下进行热处理,去除其中所含的大肠杆菌杂蛋白,最后仅需经过一步疏水柱层析,即可获得电泳纯的重组Tth-laccase,比酶活为14 U/mg,最终收率62%。3.将重组Tth-laccase首次应用于麦草浆生物漂白。当纸浆在最佳酶漂白条件(酶用量为3 U g-1绝干浆,90°C,p H 4.5,浆浓8%)下处理1.5 h后,纸浆白度提高3.3%ISO,卡伯值下降5.6。试验结果证明重组Tth-laccase处理在提高麦草浆可漂性的同时,并未对纸浆纤维造成损害。在终白度相当的情况下,使用重组Tth-laccase预处理过的浆料,可为后续无氯过氧化氢漂白节省超过25%的H2O2消耗量。若在酶漂白反应体系中添加5 mmol/L的氧化还原介体ABTS(2,2’-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)),则可以使纸浆的漂终白度继续提高1.5%ISO。这是首次报道将来源于T.thermophilus HB27的耐热性漆酶应用于纸浆生物漂白领域。4.将来源于极端嗜热细菌海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8的耐热性重组木聚糖酶Xyn B和来源于嗜热栖热菌T.thermophilus HB27的耐热性重组漆酶Tth-laccase结合,对麦草浆进行协同生物漂白。试验结果表明,当未漂浆经XL漂序(Xyn B→Tth-laccase)处理(X处理条件:20 U g-1绝干浆,p H 5.8,温度90°C,浆浓8%,漂白2 h;L处理条件:3 U g-1绝干浆,p H 4.5,温度90°C,浆浓8%,时间1.5 h),可获得最佳漂白效果。与对照浆比较,XL处理使麦草浆白度提升11.5%ISO,卡伯值降低6.9。双酶协同处理在改善浆料可漂性的同时,对纸浆质量有改善作用。在后续的无氯化学漂白段中,漂终白度相近时,采用双酶协同预处理可节省约50%的H2O2消耗量。