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子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)为子宫内膜组织在宫腔以外部位异常生长,多见于盆腔直肠子宫陷凹及卵巢表面。流行病学调查显示子宫内膜异位症在育龄妇女的患病率为10%～15%,在伴有慢性盆腔痛或不明原因的不孕患者中发生率高达40%～60%。随着对各类疾病基础研究的逐步深入,许多疾病发病的相关机制被逐渐阐明,对内异症的基础研究关注点也深入到分子机制。针对内异症的发病已经衍生出诸如经血逆流种植学说、内膜化生、免疫功能缺陷、内分泌功能失调及干细胞学说等多种假说。尽管已有一些理论和假设被提出和论证,然而内异症确切的发病机制至今仍不十分明确。神经元细胞表达的发育下调基因9(neural precursor cell expressed-developmentally down-regulated 9,NEDD9)是CAS(crk-associated substrate)家族成员之一,是一种骨架蛋白,定位在黏着斑上。作为骨架蛋白,能接收上游刺激信号并连接下游相应效应分子,在介导细胞信号转导中发挥重要功能,通过调节蛋白复合体来实现调控细胞的黏附、迁徒、侵润等生物学功能。近些年来多项研究结果显示,NEDD9的异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展、预后等相关。内异症虽属于良性的妇科疾病,但其一些增殖、侵袭和迁徙等生物学行为,与恶性肿瘤相似。我们前期的预实验发现,NEDD9在非内异症患者的内膜组织、内异症患者的在位内膜组织及异位内膜组织中都有表达,与正常子宫内膜比较NEDD9在异位内膜组织中呈差异性异常高表达,提示NEDD9可能参与子宫内膜异位症的发生发展,然而其在内异症中的具体发病机制尚不明确。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是近年来研究发现的一类调节细胞生长,分化,并与肿瘤发生有密切联系的信号分子。TGF-β1可通过smad信号通路,将信号由细胞膜转导入细胞核。活化的TGF-β能使Smad2/3 SSXS区域两个丝氨酸残基磷酸化,并进一步与Smad4结合形成复合物,进入细胞核,在辅助活化因子和抑制因子协同作用下,调节靶基因转录,参与对细胞的增殖、凋亡、分化及迁徙等细胞重构过程。研究证实,在多个正常人细胞株及肿瘤细胞系中,TGF-β1可以参与调控NEDD9的表达进而影响了细胞在增殖、侵袭、转移等生物学行为方面的异常。我们前期实验结果表明,TGF-β1在异位内膜组织中的表达显著高于在位内膜组织及非内异症患者的子宫内膜组织,推测TGF-β1异常表达有可能影响NEDD9的表达,进而参与了子宫内膜异位症发病的相关机制。本次研究的目的是检测NEDD9在非内异症患者的子宫内膜、卵巢内异囊肿患者的在位内膜及异位内膜组织中的表达,同时在原代异位内膜间质细胞中研究NEDD9异常表达对内异症细胞的增殖、侵袭和迁徙的影响,并进一步探索TGF-β1参与调控NEDD9的细胞分子机制在子宫内膜异位症发生发展中的作用。第一部分NEDD9及TGF-β1在不同内膜组织中的表达目的:研究NEDD9及TGF-β1在对照组即非内异症患者的子宫内膜、内异症在位内膜和异位内膜组织中的表达情况。方法:用Western blot和免疫组织化学法检测NEDD9及TGF-β 1蛋白表达,比较非内异症患者内膜、内异症患者在位内膜和异位内膜三者之间两种蛋白的表达和定位情况。结果:1.免疫组化结果显示NEDD9及TGF-β1在子宫内膜腺上皮和间质均有表达,且异位内膜>在位内膜>非内异症内膜,组间差异有显著性(p<0.05)。2.Westernblot结果显示NEDD9及TGF-β1在三组之间均有表达,且异位内膜>在位内膜>非内异症内膜,组间差异有显著性(p<0.05)。结论:高表达的NEDD9和TGF-β1与内异症的发生发展可能有一定的相关性。第二部分NEDD9对原代异位子宫内膜间质细胞增殖、侵袭和迁徙的影响目的:探讨NEDD9对子宫内膜间质细胞增殖、侵袭和迁徙的作用机制。方法:临床取材新鲜的内异症患者异位内膜组织,培养原代细胞,分离纯化并鉴定间质细胞。在异位内膜间质细胞中使用siRNA-NEDD9沉默NEDD9的表达,qRT-PCR及Western blot检测鉴定干扰效价。用CCK-8法检检测ED9干扰后细胞增殖情况,Transwell法检测子宫内膜间质细胞侵袭和迁徙能力的改变,同时检测MMP2和MMP9的表达情况。结果:1.非内异症患者的子宫内膜间质细胞、内异症患者异位内膜间质细胞成功进行分离、纯化和原代培养,两者细胞形态相似、呈长条梭形,状态稳定,可传代。2.成功构建siRNA-NEDD9并作用于异位内膜间质细胞,48小时后用qRT-PCR及Western blot检测NEDD9在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下调(p<0.0001)。3.CCK-8检测沉默NEDD9表达后异位内膜间质细胞增殖能力显著受限(p<0.001)。4.Transwell结果显示沉默NEDD9的表达能抑制异位内膜间质细胞的侵袭和迁徙能力。5.沉默NEDD9的表达在mRNA及蛋白水平均使MMP2和MMP9的表达下调。结论:1.NEDD9的异常表达与异位症子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭和迁徙存在相关性,NEDD9表达降低抑制异位症子宫内膜间质细胞的增殖、侵袭和迁徙。2.NEDD9可能通过MMP2和MMP9参与调控子宫内膜间质细胞的迁徙与侵袭。第三部分TGF-β1调控NEDD9在子宫内膜异位症发生发展中的作用机制目的:明确子宫内膜异位症中TGF-β1是否参与调控NEDD9的表达。方法:收集30例子宫内膜异位症患者的在位内膜组织及异位内膜组织,30例非内异症患者的子宫内膜组织,提取RNA行qRT-PCR检测TGF-β1和NEDD9的表达,并做Pearson相关性分析。临床取材新鲜的内异症患者异位内膜组织,行原代细胞培养。以2.5ng/ml的TGF-β1作用于异位内膜间质细胞,48小时后收集细胞提取总蛋白。Western blot 检测 NEDD9、TGF-β1、smad2/3、p-smad2/3 的表达。结果:1.组织样本qRT-PCR检测TGF-β1和NEDD9在异位内膜组织中显著高于在位内膜组织及非内异症内膜组织(P<0.0001),Pearson相关性分析提示TGF-β1与NEDD9的mRNA水平表达呈正相关。2.高浓度TGF-β1刺激异位内膜间质细胞48小时后,NEDD9(p<0.01)及p-smad2/3(p<0.001)的蛋白水平均显著升高,smad2/3无明显改变。结论:1.TGF-β1与NEDD9在异位内膜组织中显著高表达,且呈正相关。2.TGF-β1的高表达可使p-smad2/3及NEDD9的表达上调,提示NEDD9可能参与TGF-β1/smad信号通路,并在内异症的发生发展中起到一定的作用。