稻田养鸭不仅能除草、防虫、免耕、减少甲烷排放,提高水稻产量和品质,而且能减轻水稻纹枯病的发生和危害。本研究从两方面就稻田养鸭抑制水稻纹枯病进行探讨。一方面从鸭在稻田中的活动来研究其对水稻及水稻纹枯病菌的影响；另一方面从鸭嘴、鸭毛和鸭粪分泌物中提取粗提物和筛选微生物来研究其对水稻及水稻纹枯病菌的影响。本研究旨在通过系统研究稻田养鸭抑制水稻纹枯病的主要因素及作用机理,探索生物防治水稻纹枯病新途径。主要研究结果如下：1影响因素及作用机理研究1.1稻田养鸭对水稻纹枯病菌菌核的影响在初始菌核相同的情况下,调查放鸭区和未放鸭区纹枯病菌菌核数量。在水稻生长的分蘖末期和齐穗期,放鸭区菌核量为35.7万粒／hm2、41.9万粒／hm2,比未放鸭区菌核72.9万粒／hm2、96.4万粒／hm2,低48.97%、43.46%,表明鸭通过啄食菌核,从而减少纹枯病菌源,减轻病害发生。1.2封泥对水稻纹枯病的影响将泥砌封于水稻基部叶鞘研究其对水稻纹枯病的影响。先砌封泥于水稻叶鞘再人工接种纹枯病菌,其发病率为3.08～10.61%、病情指数为5.42～11.82,明显低于井冈霉素处理和对照的发病率3.88～55.36%和3.97～86.22%、病情指数5.66～18.40和19.94～60.72,其控病效果为72.80～81.21%,优于井冈霉素处理和对照。对先砌封泥再接病菌的处理,不同时期测定水稻的过氧化物酶活性均比对照高,但低于井冈霉素处理；同时砌封泥处理使水稻的可溶性糖含量降低。1.3鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻几丁质酶活性的影响一般认为,水稻抗病性与水稻几丁质酶活性呈正相关的。本研究采用乙酸乙酯和乙醇提取鸭毛、鸭嘴及鸭粪分泌物,并将粗提物施用于水稻,测定水稻几丁质酶活性。其中,鸭粪乙酸乙酯粗提物处理水稻后第8d水稻几丁质酶活性达最大值,为124.7 U·g(-1)·FW(-1)·min(-1),显著高于对照(77.11 U·g(-1)·FW(-1)·min(-1)),且差异显著(P<0.05,P<0.01)；鸭粪乙醇粗提物处理水稻后第8d几丁质酶活性达最大值62.9 U·g(-1)·FW(-1)·min(-1),与对照62.9U·g(-1)·FW(-1)·min(-1)比较无显著差异(P>0.05,P>0.01)；表明鸭粪乙酸乙酯粗提物能提高水稻几丁质酶活性,鸭粪乙醇提取物不能提高水稻几丁质酶活性。而鸭毛和鸭嘴乙酸乙酯、乙醇粗提物处理水稻后,水稻几丁质酶活性与对照比较也无显著变化。1.4鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻几丁质酶活性的影响采用稀释分离法分别从鸭毛、鸭嘴和鸭粪中共分离出细菌323株,真菌126株。经初步归类,从鸭毛中分离获得1株细菌B106和1株真菌F123,鸭嘴中分离获得1株细菌B75和1株真菌F66,鸭粪中分离获得1株细菌B117和1株真菌F16,并用各菌株悬浮液处理水稻。细菌B117悬浮液处理水稻后,第3d、7d水稻几丁质酶活性达最大值,分别为42.24U·g(-1)·FW(-1)·min(-1)、42.23U·g(-1)·FW(-1)·min(-1),明显高于对照41.74U·g(-1)·FW(-1)·min(-1)、41.69 U·g(-1)·FW(-1)·min(-1),且差异显著(P<0.05,P<0.02),说明鸭粪中存在能提高水稻几丁质酶活性的细菌；其它菌株F16、B106、F123、B75、F66等菌悬液处理水稻后,水稻几丁质酶活性均无显著变化。1.5鸭毛、鸭嘴和鸭粪粗提物对水稻纹枯病菌的影响采用平板拮抗法测定鸭毛、鸭嘴和鸭粪乙醇、乙酸乙酯粗提物对水稻纹枯病菌的抑制作用。鸭毛、鸭嘴和鸭粪的乙醇、乙酸乙酯粗提物抑菌效果分别为13%、8%、6%,7%、88.64%、84.11%；鸭粪乙醇粗提物在24h内对水稻纹枯病病菌ECso值为26.11mg／ml；鸭粪乙醇粗提物经萃取分离得到石油醚和乙酸乙酯两种组分,其中石油醚组分抑制效果较弱,乙酸乙酯组分抑制能力较强,对水稻纹枯病抑制率为89.70%,EC(50)值为15.52mg／ml；对乙酸乙酯组分进行硅胶柱层析分离得到5种流份,其中第2流份(L2)有显著抑菌活性,其在24h、48h内对水稻纹枯病抑制率分别为89.58%、80.36%,通过GC-MS分析鉴定,为酚酸类和硫醇类物质。本研究表明：稻田养鸭生态系统中鸭分泌物中存在抑制水稻纹枯病菌的物质。1.6鸭毛、鸭嘴和鸭粪中微生物对水稻纹枯病菌的影响采用平板对峙法将菌株B106、B75、B117,F123、F66,F16进行拮抗试验。菌株B106、B75,F123、F66,F16均无拮抗作用,而来自鸭粪中的菌株B117对水稻纹枯病菌具有较强的拮抗作用,进一步分离纯化得菌株A168。稻田养鸭生态系统中鸭分泌物中存在抑制水稻纹枯病菌的拮抗菌。2鸭粪中拮抗细菌A168筛选、鉴定、生物学特性及拮抗作用研究2.1鸭粪中拮抗细菌A168筛选、鉴定及生物学特性采用平板拮抗法,将细菌B117纯化100次,获得拮抗菌株A168,对其进行了鉴定和生物学特性研究。A168菌体杆状,革兰氏染色阳性、芽孢中生、周生鞭毛。A168菌株能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸,葡萄糖产气试验阴性,淀粉水解阴性,硝酸还原试验阳性,厌氧生长阴性,酪素分解试验阳性,酪氨酸分解试验阴性,接触酶试验阳性,VP反应阳性,苯丙氨酸脱氨酶试验阴性。16S rDNA分析与其亲缘关系较近菌株Bacillus cereus (AJ577288.1)的同源性达99%,初步鉴定A168菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),其16SrDNA序列已在GenBank中注册,登录号为GQ118339。A168菌株最优培养时间60h,最适温度28℃、最适pH 7.0。A168菌株能利用的碳源有蔗糖、葡萄糖、甘露醇、α-乳糖、D-木糖、麦芽糖、D-半乳糖、D-果糖；能利用的氮源有胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸膏、干酪素,氯化铵等,但不能利用硝酸钾。2.2 A168菌株活性物质的提取条件及抑菌机理研究采用乙酸乙酯以物料比4：1,在28℃条件下连续超声萃取36h提取A168菌株活性物质效果最好。A168菌株活性物质对水稻纹枯病菌(R.solani)的ECso和EC90值分别为2.15mg／mL和237.86mg／mL；经处理的水稻纹枯病菌菌丝扭曲；当浓度为35mg／mL时,可溶性蛋白质的合成抑制率最大为24.45%,菌核萌发率最低为80.36%；水稻纹枯病菌致病力随活性物质浓度的提高而降低,当浓度为45mg／mL时,纹枯病菌被抑制率为80.29%；A168菌株活性物质对病原菌菌丝体电导率无影响。A168菌株活性物质可通过抑制菌丝生长、蛋白质合成、菌核萌发、降低病菌致病力等途径达到控制纹枯病发生。2.3 A168菌株最优培养基及发酵条件研究通过正交试验确定菌株A168的最优发酵培养基配方及发酵条件：豆饼粉2%,葡萄糖7%,CaCO3 0.4%,NaCL 0.35%,蛋白胨6%。摇瓶最优发酵条件：培养时间48h,温度28℃,菌龄24h,接种量6%,转速为200r／min,装液量为210ml(摇瓶500mL),pH值7.0。10L发酵罐最优发酵条件：通气量为180L／h,转速为200r／min,温度为28℃,初始pH为6.5,最优发酵时间为72h。2.4 A168菌株在水稻上定殖规律及对水稻纹枯病田间防治效果研究采用回收标记菌株法探索了A168菌株定殖规律及田间防效。以摩擦方式定殖A168菌量最多；在分蘖期菌量最大,水稻齐穗期次之,成熟期最少；水稻基部叶鞘定殖的菌量高于根部和茎部；在接种后32d仍能够回收到活菌；田间防效达78.47%,明显高于井冈霉素。表明A168菌株在水稻上定殖能力强防病效果较好。2.5 A168菌株促生、抗病及增产效果研究经A168菌悬液处理水稻幼苗比对照根长、株高、叶长和鲜重分别增长12.35～30.95%、26.52～30.77%、16.37～20.02%和10.26～29.52%；且对"Lemont"“陆两优996”品种的促生效果比“创丰1号”好；经A168菌悬液处理的水稻"Lemont"内吲哚乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR4)、赤霉素(GA3)的含量比对照高,脱落酸(ABA)的含量比对照低；苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性比对照高,但过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性与对照比较无显著变化；经A168菌悬液处理后的水稻产量比对照高,其中“陆两优996"品种增产最大为13.13%,其次为"Lemont"品种,“创丰1号”品种增产最低。本研究结果表明：A168菌株具有促进水稻生长,提高水稻抗病性及增加水稻产量的作用。2.6 A168菌株活性物质的分离、纯化及鉴定采用生化反应、硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFF、FPLC Phenyl FF疏水色谱柱、HPLC C18液相色谱纯化等方法研究A168菌株活性物质成分并进行了分离、纯化及鉴定。初步鉴定A168过滤液中含有蛋白质和肽,进一步分离、纯化获得拮抗纹枯病菌L-518样品。通过SDS-PAGE电泳可知,L-518样品约有15KD,再经质谱分析其质荷比为15006.899。L-518样品不耐高温,对蛋白酶K稳定,对胰蛋白酶和胃蛋白酶不稳定,这些性质与多肽基本相似,初步鉴定为多肽类物质。