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小RNA是生物体生命活动的重要调控因子，在生物的生长发育中发挥非常重要的作用。部分小RNA行使基因调控功能的过程依赖于Argonaute（AGO）蛋白等结合形成的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），在RISC复合体的作用下小RNA能与靶基因结合并对靶基因进行剪切或抑制其翻译。因此，通常应用免疫共沉淀AGO蛋白的方法将与之结合的小RNA及靶基因一起分离，再通过高通量测序和生物信息学分析方法对这些RNA进行分析，并通过后续实验进行验证，探究小RNA与调控靶基因之间的相关性。前期研究我们利用免疫共沉淀成功分离了长度为200nt以上的与BmAGO2结合的小RNA，并对其进行了高通量测序和生物信息学分析，分析发现BmAGO2结合的小RNA中，转座子（Transposable elements，TEs）来源的小RNA占总RNA的47.78％。因此本研究通过Northern Blotting的方法对转座子来源的小RNA进行进一步鉴定与表达分析，并利用真核表达和RNA干扰(RNAi)方法上调和下调AGO蛋白，分析AGO蛋白上调和下调表达对TEs表达的影响，阐明RISC复合体对TEs的调控功能。 首先用生物学软件将前期研究得到的BmAGO2结合小RNA与 BmAGO2结合的1,694条TEs进行匹配，得到家蚕中TEs与小RNA的匹配图谱，表明这些小RNA来源于TEs，命名为TEs来源小RNA（TE-siRNA），它们可能为类似于siRNA的新型小RNA分子。合成小RNA特异探针，Northern Blotting鉴定杆状病毒感染家蚕BmN细胞和正常BmN细胞中的TE-siRNA。检测结果显示，大部分TE-siRNA被成功检测到，如TE-siRNA413、TE-siRNA610、TE-siRNA479、TE-siRNA649、TE-siRNA134和TE-siRNA671等，在这些被检测出的TE-siRNA中，除TE-siRNA479外，其他小RNA均位于转座子bm1645上，表明bm1645可能为一个产生小RNA的“pool”。和正常细胞相比，部分TE-siRNA在杆状病毒感染细胞中表达水平上调，表明这些小RNA可能和病毒侵染相关，而部分TE-siRNA则维持了相对稳定的表达水平。进一步Northern Blotting鉴定正常和杆状病毒感染五龄蚕、蛹、蛾三个时期中的TE-siRNA表达情况和正常卵中的TE-siRNA表达情况，结果显示，在家蚕的不同生长时期均能检测到部分TE-siRNA的表达，但各个时期检测到的TE-siRNA并不完全相同，表明某些TE-siRNA只存在于特定的家蚕生长发育时期，未检测到的TE-siRNA也有可能由于含量太低导致信号弱而未被检测出。TE-siRNA在家蚕发育时期的差异表达表明，其可能在家蚕特定的发育时期行使特定的基因调控功能，还有待进一步研究。 和miRNA或siRNA通路相似，TE-siRNA和BmAGO2结合可能形成RISC复合物从而调控靶向TEs的表达。因此我们进一步开展了BmAGO2过表达对TEs基因转录水平影响的研究。转染重组真核表达载体pIEX-1-BmAGO2到家蚕细胞中，qRT-PCR检测表明成功上调BmAGO2基因的表达水平，同样应用qRT-PCR检测此时细胞中TEs的转录水平变化，结果显示，BmAGO2转录水平上调后可导致R1-3_BM、M19755、AK380858.1和Mariner-1-BM等转座子的转录水平出现下调，而大量BmAGO2结合的TE-siRNA来源于这些下调的转座子中，表明BmAGO2介导的RISC复合体可能结合TE-siRNA从而调控这些转座子的表达，其机制可能类似于siRNA的基因调控通路，具体机制还有待进一步研究。另外，我们还研究了Argonaute蛋白家族的其他两个成员BmAGO3和BmSIWI的下调表达对TEs基因转录水平的影响。应用RNAi干扰技术，将体外合成的双链RNA-BmAGO3-dsRNA和BmSIWI-dsRNA转染到家蚕细胞中使细胞中BmAGO3和BmSIWI的转录水平下调，应用qRT-PCR检测此时细胞中TEs转录水平的变化，结果显示，BmAGO3基因的下调可导致bm1157、AK380858.1和R1-3_BM等转座子转录水平发生上调；而 BmSIWI基因的下调可导致 bm1157、AB480244.1、L1BM、AK380858.1、Mariner-1-BM、R1-3_BM和M19755等转座子转录水平发生上调，表明TE-siRNA分子可能和不同的AGO蛋白结合行使调控TEs的功能。 另外，我们还检测了家蚕细胞中杆状病毒表达BmAGO2的表达时相，表明在12hr开始， BmAGO2蛋白就获得较高表达，并在72hr之内持续表达上调，这为进一步开展BmAGO2免疫共沉淀方法研究BmAGO2介导的TE-siRNA的基因调控功能打下基础。