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研究背景:乳腺癌是全世界严重危害女性健康常见的恶性肿瘤,2018年美国癌症学会期刊表明,全球乳腺癌占女性癌症新发病例的24.2%,新发病例约200万,位居女性癌症发病之首。我国国家癌症中心数据显示2014年我国乳腺癌新发病例为27.49每万例次,在我国女性癌症发病中同样位居第一,乳腺癌患病率呈逐年上升状态,发病年龄正趋向年轻化发展。如今,随着医疗科技的发展,乳腺癌的治疗进入综合治疗时代,治疗手段包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗和生物免疫治疗等。手术是乳腺癌的主要治疗方式,术后根据乳腺癌的病理分期、激素敏感性、基因等将乳腺癌分类,再给予不同的辅助治疗方案。但是无论使用哪种方案,绝大多数患者都会接触到化疗,因此化疗在乳腺癌的治疗中具有非常重要的作用。环磷酰胺(CTX)作为常用的化疗药,在体外无活性,进入人体后经肝脏生物转化,代谢产物磷酰胺氮芥会损伤肿瘤细胞DNA,阻滞细胞周期,抑制肿瘤细胞的增殖及促进肿瘤细胞凋亡,但是临床上长疗程大剂量使用CTX会引起较强的副作用,CTX在体内代谢会产生大量的活性氧自由基(ROS),干扰体内的氧化还原平衡,加重全身各器官的不良反应。因此,如果能够找到一种有效清除自由基并具有协助杀伤肿瘤细胞的制剂,就能有效地减轻CTX导致的毒副作用,增强CTX对肿瘤细胞的杀伤效果。银杏叶提取物(GBE)是从银杏叶中提取的活性成分,其主要成分为黄酮,具有良好的清除自由基抗氧化能力,同时具有杀伤肿瘤细胞的作用。因此,本实验建立小鼠EMT6乳腺癌模型,单独和联合给予CTX和GBE,评价GBE增强CTX杀伤肿瘤细胞的效果并探讨其可能机制。目的:研究银杏叶提取物增强环磷酰胺杀伤肿瘤细胞的作用及可能的机制。方法:1.细胞培养:培养小鼠乳腺癌EMT6细胞。2.动物处理:健康雌性ICR小鼠60只,随机分为五组,包括Control(对照组),PBS,CTX,GBE,GBE+CTX组。除Control组外,其余四组均在小鼠左后肢外侧皮下接种1×10~6个EMT6细胞进行造模。CTX给药剂量为2 mg/kg,隔日腹腔注射,GBE给药剂量为3 mg/kg,每日腹腔注射,Control组不做任何处理,PBS组每日腹腔注射等量PBS,每日进行体重称量。3.评价GBE和CTX杀伤肿瘤细胞的效果:记录并计算各组小鼠肿瘤的潜伏期,测量肿瘤长径短径并计算肿瘤体积,剥离肿瘤后测肿瘤重量并计算肿瘤抑制率。4.小鼠血清和肿瘤组织酶学检测:检测各组小鼠血清和肿瘤组织中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。5.小鼠肿瘤组织中NF-κB通路相关蛋白的检测:Western bIot方法检测PI3K、Akt、IκB-α、P-IκB-α、NF-κB、P-NF-κB蛋白的表达水平。6.小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白的检测:Western bIot方法检测Bax、Bcl-2、Caspase-8、FADD、Cyto-C、P53蛋白的表达水平。结果:1.杀伤肿瘤细胞效果的评价:GBE+CTX、CTX和GBE组肿瘤重量显著低于PBS组,GBE+CTX组肿瘤重量显著低于CTX和GBE组(P<0.05)。GBE+CTX、CTX和GBE组肿瘤体积显著低于PBS组,GBE+CTX组肿瘤体积显著低于CTX和GBE组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组肿瘤潜伏期高于PBS、GBE和CTX组,CTX和GBE组肿瘤潜伏期高于PBS组,GBE+CTX组肿瘤抑制率显著高于CTX和GBE组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.小鼠血清和肿瘤组织中MDA含量和SOD活力的比较:PBS组血清MDA含量显著高于Control组,GBE+CTX组血清MDA含量显著低于PBS、GBE和CTX组。PBS组血清SOD活力显著低于Control组,GBE+CTX组血清SOD活力显著高于PBS、GBE和CTX组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组肿瘤组织中MDA含量显著低于PBS、GBE和CTX组,GBE+CTX组肿瘤组织中SOD活力显著高于PBS、GBE和CTX组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。3.小鼠肿瘤组织中NF-κB通路相关蛋白表达的比较:GBE+CTX组PI3K,Akt蛋白表达水平均显著低于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组PI3K,Akt蛋白表达水平均显著低于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组NF-κB、P-NF-κB和P-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平均显著低于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组NF-κB、P-NF-κB和P-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平均显著低于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组IκB-α、P-IκB-α和P-IκB-α/IκB-α蛋白表达水平均显著低于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组IκB-α、P-IκB-α和P-IκB-α/IκB-α蛋白表达水平均显著低于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达的比较:GBE+CTX组Caspase8、FADD和Cyto-C蛋白表达水平显著高于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组Caspase8、FADD和Cyto-C蛋白表达水平显著高于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组Bax蛋白表达水平显著高于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组Bax蛋白表达水平显著高于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组Bcl-2蛋白表达水平显著低于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组Bcl-2蛋白表达水平显著低于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组Bax/Bcl-2比值显著高于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组Bax/Bcl-2比值显著高于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。GBE+CTX组P53蛋白表达水平显著高于PBS、CTX和GBE组,CTX和GBE组P53蛋白表达水平显著高于PBS组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.GBE与CTX联合应用抑制小鼠乳腺癌细胞生长的效果显著好于CTX单独应用。2.GBE与CTX联合应用可以改善小鼠的抗氧化能力。3.GBE可以通过调节小鼠乳腺癌组织中NF-κB通路相关蛋白的表达来增强CTX杀伤肿瘤细胞的效果。4.GBE可以通过调节小鼠乳腺癌组织中凋亡相关蛋白的表达来增强CTX杀伤肿瘤细胞的效果。