血栓栓塞导致的疾病,尤其是急性心肌梗塞,是危害现代人类健康的主要疾病之一。与现有的溶栓制剂如尿激酶、链激酶以及t-PA相比,近年来正在开发一些价格更低廉来源更安全的纤溶制剂。其中,来源于日本传统的发酵食品-纳豆中的纳豆激酶(NK),由于其溶栓作用引起了广大学者的兴趣。NK的分子量和等电点分别是28kDa和8.6。NK在消化道内具有pH和温度的稳定性。NK可以直接降解纤维蛋白、将纤溶酶原激活为纤溶酶、还能够降解和失t-PA的抑制剂PAI一1。目前为止,NK的研究主要集中在它的纤溶作用和机制、异源表达和纯化方面。NK能否成为新一代的溶栓制剂还主要取决于NK性能的提高,如延长半衰期、提高酶活力和热稳定性等,因而有必要进行NK分子的改造研究。NK的全基因序列,aprN,已经通过鸟枪法获得,并且推导出了NK的一级结构的氨基酸残基序列。体外分子进化是改造蛋白质以改善或提高其某些特性的最有效的方法。本研究探索了如何用体外定向进化技术提高NK的纤溶活性以提高其在医疗上的应用价值。突变文库的理想筛选方法是表达产物有活性而且能分泌到胞外,通过检测对分泌产物就可以判断突变酶的活性高低。我们首先构建了三个分泌表达系统大肠杆菌BL21(DE3)plysS-pETSN、枯草芽孢杆菌WB600-pSGNK和毕赤酵母GS115-pPINK。利用纳豆激酶活性测定方法与平板筛选策略相结合建立了高通量的筛选纤溶活性提高的纳豆激酶的方法。该方法将突变文库转移到脱脂牛奶平板上,产生的透明溶解圈清晰,使筛选变得直观,操作简单,费用低,在鉴别纤溶活性提高的突变体时比较有效。我们利用NK、枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg三种酶蛋白编码基因做为亲本。通过DNA家族改组技术使三种亲本基因进行重组,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS构建突变文库。通过观察平板上透明圈的大小,突变文库经过LB脱脂牛奶平板初筛和小量表达上清在纤维蛋白平板上复筛,获得了纤溶活性比野生型NK高的NK突变体(MN)。通过对MN与三种亲本酶蛋白NK、SB、SC的一级结构的氨基酸残基的序列比对,发现酶的催化三联体(D32,H64,S221)和底物结合位点(S125,L126,G127)是比较保守的,都没有发现突变。在所有突变的氨基酸残基中,有9个是来源于酶蛋白SB,其余的是与SB和SC的氨基酸残基都是一样的,没有新的突变引入到MN的氨基酸残基中。为了了解这些突变位点的作用,我们构建了MN的三维结构模型,并显示了这些突变氨基酸残基的分布。酶的活性中心和底物结合位点由2个α-螺旋和7个β-折叠组成,并且都处于酶蛋白表面的疏水腔里,没有一个突变是分布在这些严格保守的区域内。大部分突变的氨基酸残基远离酶蛋白表面的疏水腔,其中两个突变的氨基酸残基A150V和T224S距离活性心中的S221残基最近。通过分析,这两个突变并没有与其他氨基酸残基形成氢键,但是所有突变的氨基酸残基共同作用形成了一个更大的活性中心的疏水腔。这些结果分析表明酶的疏水腔在酶与底物的结合中起着非常重要的作用。通过酶学性质的研究,我们发现MN和NK都能够在大肠杆菌中进行活性表达,且能纯化到比较纯的一条带,通过SDS-PAGE和免疫印迹鉴定其分子量大约是28kDa。MN的纤溶活性是野生型NK的2.1倍多,而且MN的催化效率也高于野生型NK,提高了2.13倍。另外,酶蛋白的抗氧化能力的测定也表明MN的抗氧化能力大于野生型NK。野生型NK和MN的最适pH和pH稳定性相差不大,在pH5-11范围内,酶活性都是比较稳定的。野生型NK和MN的最适温度和热稳定性也没有发现明显的区别,只是MN的热稳定性稍高于野生型NK。我们的研究工作表明利用DNA家族改组构建突变文库来定向进化NK是可行的。因为突变酶的酶特性的提高,将成为溶栓治疗方面一个理想的和经济的选择。