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恶性肿瘤在全球的发病率逐年升高，已成为世界范围内的公共卫生问题。随着经济社会的发展，前列腺癌已成为我国男性中发病率第七位的恶性肿瘤。多数前列腺癌患者在确诊时已处于中晚期，经雄激素剥夺及根治性手术切除治疗后，常出现肿瘤的耐药及转移，导致预后不佳。卵巢癌是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤。由于早期症状不典型，多数患者在确诊时已出现局部或远处转移，应用手术切除、放化疗等综合治疗手段后，肿瘤病人的高复发率和高死亡率仍未得到改善。寻求更有效的诊断标志物，探索新的靶向治疗策略，已成为前列腺癌和卵巢癌相关研究领域的重点。
鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）属于鸟苷酸结合蛋白家族的一员，是一类发动蛋白，可由干扰素和多种细胞因子诱导表达，广泛参与抗病毒、抗细菌、抗原虫、炎症反应等多种生物学过程。近年来，越来越多研究发现GBP1在肿瘤的发生发展中起着重要作用，与肿瘤生长、肿瘤侵袭、血管生成、复发转移等关系密切。但GBP1在前列腺癌和卵巢癌中的作用研究仍较少，其作用机制也有待进一步的研究。
我们在前期针对前列腺癌细胞系模型的研究中发现，经过溴化乙锭或细胞周期抑制剂弗拉平度长期处理后，存活的细胞表现出代谢重编程和更强的侵袭性特征，并且GBP1在这些细胞中均出现表达上调。因此，本研究应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建了GBP1基因敲除的四个独立的前列腺癌和卵巢癌细胞系模型，探索了GBP1基因在肿瘤细胞生物学功能及特性方面的作用。随后，结合裸鼠体内成瘤实验，进一步验证了GBP1基因的作用并对相关机制进行了探讨。最后，通过IHC染色检测了GBP1蛋白在前列腺癌和卵巢癌组织样本中的表达水平，评估了GBP1表达和患者临床病理参数及预后的相关关系。
第一部分：GBP1基因敲除的前列腺癌和卵巢癌细胞系的构建及功能研究
研究方法：
1.利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对前列腺癌细胞系DU145、PC3和卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3进行GBP1基因的敲除，挑选单克隆，建立稳定的GBP1基因敲除细胞系，并用细胞免疫化学（ICC）和蛋白免疫印迹（Western blot）实验验证基因敲除细胞GBP1蛋白表达；
2.利用Incucyte ZOOM活细胞成像系统动态监测细胞的增殖，采用流式细胞技术分析细胞周期，Transwell实验和细胞划痕实验检测细胞迁移能力的改变，Incucyte ZOOM系统和平板克隆实验评估细胞药物敏感性，应用Seahorse XFe96仪器检测细胞的能量代谢状态，分析GBP1基因敲除后前列腺癌和卵巢癌细胞系细胞氧耗及胞外酸化速率的改变。
研究结果：
1.成功构建了GBP1基因稳定敲除的DU145、PC3、SKOV3和OVCAR3细胞系模型，命名为DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO细胞；
2.GBP1基因敲除细胞和亲本细胞相比，呈现出增殖能力减低，细胞周期抑制，迁移能力下降，细胞药物敏感性提高，细胞能量代谢处于氧化磷酸化和糖酵解均受抑制的状态。
第二部分：GBP1对前列腺癌和卵巢癌细胞体内成瘤能力影响的相关研究
研究方法：
1.裸鼠成瘤实验检测GBP1基因敲除后肿瘤细胞体内成瘤能力的变化。
2.苏木素-伊红（HE）染色观察裸鼠肿瘤的组织形态学变化。
3.免疫组织化学（IHC）染色检测裸鼠肿瘤组织中GBP1蛋白的表达情况。
研究结果：
1.裸鼠荷瘤后，DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞在体内成瘤生长速度相较于对照组细胞更为缓慢，成瘤体积较小，SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞的裸鼠成瘤率也较低。2.HE染色发现DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组肿瘤组织细胞异型性及核分裂相减少。
3.IHC染色观察到裸鼠肿瘤组织中DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组的GBP1表达水平明显低于对照组。
第三部分：GBP1在前列腺癌和卵巢癌中的作用机制研究
研究方法：
1.使用ICC、IHC法及Western blot实验检测肿瘤细胞及裸鼠瘤体中EGFR蛋白表达情况，验证EGFR的表达是否受GBP1表达影响。；
2.对DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO、OVCAR3GBP1KO细胞以及各自的亲本细胞进行转录组测序，分析差异表达基因和差异基因相关的GO、KEGG通路方面变化。
3.使用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络。
研究结果：
1.ICC和Western blot实验发现细胞系中，GBP1基因敲除后细胞中EGFR表达水平下降；IHC实验结果表明裸鼠瘤体样本中EGFR蛋白表达也因GBP1基因敲除而出现下调。这些结果提示EGFR在前列腺癌和卵巢癌细胞中表达受GBP1蛋白表达的影响。
2.转录本测序结果提示DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞的细胞角蛋白（KRT）家族相关基因表达表达显著下调，使用荧光定量PCR（RT-PCR）再次检测和转录本测序保持一致。
3.PPI网络提示GBP1同EGFR间的蛋白互作仅有文献证据支持，GBP1同KRT家族成员间无直接蛋白互作证据,体现本研究的创新性和真实性。
第四部分：前列腺癌和卵巢癌组织中GBP1的表达与临床病理参数及预后的关系
研究方法：
1.使用IHC方法，检测105例前列腺癌临床组织中GBP1蛋白的表达情况，分析GBP1蛋白表达和前列腺癌临床病理参数以及患者生存期之间的相关关系。
2.利用IHC染色，检测100例卵巢癌临床样本中GBP1蛋白表达的情况，评估GBP1蛋白表达同卵巢癌临床病理特征的相关性；进一步分析GBP1蛋白表达和浆液性卵巢癌的临床病理学参数的相关关系
3.采用SPSS软件对结果进行统计学分析。利用Chi-square或Fisher`s精确检验方法分析GBP1蛋白表达和临床变量间的相关关系；采用Kaplan-Meier方法评估患者生存期，利用log-rank检验进行组间差异比较；引入COX回归方法分析各指标对预后的影响。
研究结果：
1.GBP1在前列腺癌患者临床样本中绝大多数（93.33%）呈阳性表达，GBP1蛋白的表达与和患者的Gleason评分具有显著正相关性，GBP1高表达与患者较短的总生存期（OS）密切相关。
2.100例卵巢癌组织标本中，GBP1蛋白均呈阳性表达。GBP1蛋白的表达和FIGO分期具有正相关关系，和肿瘤组织分化程度呈负相关关系；卵巢浆液性癌组织样本中，GBP1蛋白表达同患者的FIGO分期存在正相关关系、同样本组织分化程度存在负相关关系.
3.多变量检验分析结果提示，在前列腺癌组织标本中，GBP1蛋白表达、Gleason评分、TNM分期可以作为前列腺癌患者总生存率的独立预测因子。
研究结论：
1.GBP1基因敲除前列腺癌及卵巢癌细胞出现了增殖能力减弱、细胞周期抑制、迁移能力下降、化疗敏感性升高，同时细胞能量代谢中线粒体氧化磷酸化和糖酵解均受抑制，提示GBP1和前列腺癌及卵巢癌的恶性进展相关。
2.在DU145、PC3、SKOV3和OVCAR3细胞中敲除GBP1基因后，肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显下降，验证了体外实验结果，也说明了GBP1在前列腺癌和卵巢癌发生发展中的作用。
3.前列腺癌及卵巢癌细胞中GBP1基因敲除后EGFR蛋白表达下调，裸鼠瘤体中EGFR蛋白在GBP1基因敲除组也出现表达水平下降；GBP1基因敲除后，KRT家族相关基因明显下调，提示GBP1可能通过参与EGFR通路，以及影响KRT家族成员的表达，从而在肿瘤中发挥作用。
4.人前列腺癌组织中，GBP1蛋白表达和Gleason评分呈正相关，GBP1的高表达与患者OS较短显著相关；在卵巢癌组织中，GBP1蛋白的表达和FIGO分期及组织分化程度显著相关；说明GBP1在前列腺癌及卵巢癌的发生及进展过程中具有重要作用。
鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）属于鸟苷酸结合蛋白家族的一员，是一类发动蛋白，可由干扰素和多种细胞因子诱导表达，广泛参与抗病毒、抗细菌、抗原虫、炎症反应等多种生物学过程。近年来，越来越多研究发现GBP1在肿瘤的发生发展中起着重要作用，与肿瘤生长、肿瘤侵袭、血管生成、复发转移等关系密切。但GBP1在前列腺癌和卵巢癌中的作用研究仍较少，其作用机制也有待进一步的研究。
我们在前期针对前列腺癌细胞系模型的研究中发现，经过溴化乙锭或细胞周期抑制剂弗拉平度长期处理后，存活的细胞表现出代谢重编程和更强的侵袭性特征，并且GBP1在这些细胞中均出现表达上调。因此，本研究应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建了GBP1基因敲除的四个独立的前列腺癌和卵巢癌细胞系模型，探索了GBP1基因在肿瘤细胞生物学功能及特性方面的作用。随后，结合裸鼠体内成瘤实验，进一步验证了GBP1基因的作用并对相关机制进行了探讨。最后，通过IHC染色检测了GBP1蛋白在前列腺癌和卵巢癌组织样本中的表达水平，评估了GBP1表达和患者临床病理参数及预后的相关关系。
第一部分：GBP1基因敲除的前列腺癌和卵巢癌细胞系的构建及功能研究
研究方法：
1.利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对前列腺癌细胞系DU145、PC3和卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3进行GBP1基因的敲除，挑选单克隆，建立稳定的GBP1基因敲除细胞系，并用细胞免疫化学（ICC）和蛋白免疫印迹（Western blot）实验验证基因敲除细胞GBP1蛋白表达；
2.利用Incucyte ZOOM活细胞成像系统动态监测细胞的增殖，采用流式细胞技术分析细胞周期，Transwell实验和细胞划痕实验检测细胞迁移能力的改变，Incucyte ZOOM系统和平板克隆实验评估细胞药物敏感性，应用Seahorse XFe96仪器检测细胞的能量代谢状态，分析GBP1基因敲除后前列腺癌和卵巢癌细胞系细胞氧耗及胞外酸化速率的改变。
研究结果：
1.成功构建了GBP1基因稳定敲除的DU145、PC3、SKOV3和OVCAR3细胞系模型，命名为DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO细胞；
2.GBP1基因敲除细胞和亲本细胞相比，呈现出增殖能力减低，细胞周期抑制，迁移能力下降，细胞药物敏感性提高，细胞能量代谢处于氧化磷酸化和糖酵解均受抑制的状态。
第二部分：GBP1对前列腺癌和卵巢癌细胞体内成瘤能力影响的相关研究
研究方法：
1.裸鼠成瘤实验检测GBP1基因敲除后肿瘤细胞体内成瘤能力的变化。
2.苏木素-伊红（HE）染色观察裸鼠肿瘤的组织形态学变化。
3.免疫组织化学（IHC）染色检测裸鼠肿瘤组织中GBP1蛋白的表达情况。
研究结果：
1.裸鼠荷瘤后，DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞在体内成瘤生长速度相较于对照组细胞更为缓慢，成瘤体积较小，SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞的裸鼠成瘤率也较低。2.HE染色发现DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组肿瘤组织细胞异型性及核分裂相减少。
3.IHC染色观察到裸鼠肿瘤组织中DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组的GBP1表达水平明显低于对照组。
第三部分：GBP1在前列腺癌和卵巢癌中的作用机制研究
研究方法：
1.使用ICC、IHC法及Western blot实验检测肿瘤细胞及裸鼠瘤体中EGFR蛋白表达情况，验证EGFR的表达是否受GBP1表达影响。；
2.对DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO、OVCAR3GBP1KO细胞以及各自的亲本细胞进行转录组测序，分析差异表达基因和差异基因相关的GO、KEGG通路方面变化。
3.使用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络。
研究结果：
1.ICC和Western blot实验发现细胞系中，GBP1基因敲除后细胞中EGFR表达水平下降；IHC实验结果表明裸鼠瘤体样本中EGFR蛋白表达也因GBP1基因敲除而出现下调。这些结果提示EGFR在前列腺癌和卵巢癌细胞中表达受GBP1蛋白表达的影响。
2.转录本测序结果提示DU145GBP1KO、PC3GBP1KO、SKOV3GBP1KO和OVCAR3GBP1KO组细胞的细胞角蛋白（KRT）家族相关基因表达表达显著下调，使用荧光定量PCR（RT-PCR）再次检测和转录本测序保持一致。
3.PPI网络提示GBP1同EGFR间的蛋白互作仅有文献证据支持，GBP1同KRT家族成员间无直接蛋白互作证据,体现本研究的创新性和真实性。
第四部分：前列腺癌和卵巢癌组织中GBP1的表达与临床病理参数及预后的关系
研究方法：
1.使用IHC方法，检测105例前列腺癌临床组织中GBP1蛋白的表达情况，分析GBP1蛋白表达和前列腺癌临床病理参数以及患者生存期之间的相关关系。
2.利用IHC染色，检测100例卵巢癌临床样本中GBP1蛋白表达的情况，评估GBP1蛋白表达同卵巢癌临床病理特征的相关性；进一步分析GBP1蛋白表达和浆液性卵巢癌的临床病理学参数的相关关系
3.采用SPSS软件对结果进行统计学分析。利用Chi-square或Fisher`s精确检验方法分析GBP1蛋白表达和临床变量间的相关关系；采用Kaplan-Meier方法评估患者生存期，利用log-rank检验进行组间差异比较；引入COX回归方法分析各指标对预后的影响。
研究结果：
1.GBP1在前列腺癌患者临床样本中绝大多数（93.33%）呈阳性表达，GBP1蛋白的表达与和患者的Gleason评分具有显著正相关性，GBP1高表达与患者较短的总生存期（OS）密切相关。
2.100例卵巢癌组织标本中，GBP1蛋白均呈阳性表达。GBP1蛋白的表达和FIGO分期具有正相关关系，和肿瘤组织分化程度呈负相关关系；卵巢浆液性癌组织样本中，GBP1蛋白表达同患者的FIGO分期存在正相关关系、同样本组织分化程度存在负相关关系.
3.多变量检验分析结果提示，在前列腺癌组织标本中，GBP1蛋白表达、Gleason评分、TNM分期可以作为前列腺癌患者总生存率的独立预测因子。
研究结论：
1.GBP1基因敲除前列腺癌及卵巢癌细胞出现了增殖能力减弱、细胞周期抑制、迁移能力下降、化疗敏感性升高，同时细胞能量代谢中线粒体氧化磷酸化和糖酵解均受抑制，提示GBP1和前列腺癌及卵巢癌的恶性进展相关。
2.在DU145、PC3、SKOV3和OVCAR3细胞中敲除GBP1基因后，肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显下降，验证了体外实验结果，也说明了GBP1在前列腺癌和卵巢癌发生发展中的作用。
3.前列腺癌及卵巢癌细胞中GBP1基因敲除后EGFR蛋白表达下调，裸鼠瘤体中EGFR蛋白在GBP1基因敲除组也出现表达水平下降；GBP1基因敲除后，KRT家族相关基因明显下调，提示GBP1可能通过参与EGFR通路，以及影响KRT家族成员的表达，从而在肿瘤中发挥作用。
4.人前列腺癌组织中，GBP1蛋白表达和Gleason评分呈正相关，GBP1的高表达与患者OS较短显著相关；在卵巢癌组织中，GBP1蛋白的表达和FIGO分期及组织分化程度显著相关；说明GBP1在前列腺癌及卵巢癌的发生及进展过程中具有重要作用。