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产黄青霉(Penicillium chrysogenum),是工业上用于发酵生产β-内酰胺类抗生素—青霉素的重要真菌。作为丝状真菌,它一般是通过菌丝延伸和分枝进行生长,但具体的调控机制尚未完全了解。先前的研究表明青霉素的分泌与菌丝延伸速率及顶端生长有关,因此对产黄青霉进行形态学描述具有重要意义。 几丁质是大部分丝状真菌中细胞壁的主要组成成分,其合成是一个复杂的过程,关键酶为几丁质合成酶。几丁质合成酶(EC2.4.1.16)的作用是催化N-乙酰葡萄糖胺残基通过β-1,4-糖苷键连接成几丁质。许多研究表明,几丁质合成酶具有结构和功能多样性,并且在曲霉属(Aspergillus)的生长和形态发生中起重要作用,然而产黄青霉中还未见相关方面的研究报道。 本文利用BLAST工具从产黄青霉中搜索与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中几丁质合成酶具有相似性的基因,共找到三个同源性序列,分别编码Ⅲ类几丁质合成酶CHS4和两个假定蛋白,核酸序列一致性介于74%和78%之间,氨基酸序列一致性分别为87%、76%和74%。我们选择一致性最高并编码Ⅲ类几丁质合成酶CHS4的基因chs4作为目的基因进行深入研究。 通过构建干扰载体来研究chs4的基因功能。为达到高的转化率,对影响原生质体制备和再生的因素进行了分析。结果表明,当菌龄为48 h,裂解酶浓度为4 mg/mL,酶解温度为30℃,酶解时间为5h时,原生质体产量最高,达到1.41×107个/mL。而当酶解时间为4h,平板上层琼脂浓度为1%时可以达到最高的再生率,约为33%。 载体转入产黄青霉后,用反转录PCR和荧光定量PCR检测chs4的表达水平,发现各菌chs4基因沉默的程度有所不同。转化株形态与原始菌有很大不同,生长缓慢,菌丝短且分枝多。所有转化株的生长速度和孢子产生率相对于原始菌都有明显地下降,暗示着chs4在菌丝发育和孢子形成中有重要作用。 显微镜观察各菌株在液体发酵中的菌丝形态。种子时期,除了PcRNAi1-15形态与原始菌类似外,其它菌的菌丝生长都有严重缺陷。特别是PcRNAi1-17,它的菌丝短小膨胀,并且发育不良。PcRNAi2-1与PcRNAi2-6的菌丝都变得较为粗短,并且分枝较原始菌多。而且PcRNAi1-17与PcRNAi2-1明显慢于其他菌,菌液很稀,菌丝多结团成球。进入发酵期后,各个菌的菌丝都发生缠绕形成菌丝团,菌丝缠绕的紧密度由大到小依次为:PcRNAi1-17> PcRNAi2-1>PcRNAi2-6≥Pcoriginal> PcRNAi1-15。PcRNAi1-17与PcRNAi2-1很快就形成了带有致密核的菌丝球,并且PcRNAi1-17的菌球直径明显大于PcRNAi2-1。 除PcRNAi1-15外的其它转化株青霉素产量都高于原始菌,特别是PcRNAi1-17和PcRNAi2-1,它们的青霉素产量分别比原始菌高27%和41%。由此推断,形态的变化对青霉素产量有一定的影响,可能与菌丝的分枝增多有关。另外菌球的形成使得发酵液粘度下降,有利于营养物质传递,可能也是青霉素产量提高的一个原因。