论文部分内容阅读
牡丹种子在萌发过程中存在上胚轴休眠问题,自然条件下种子萌发耗时长,出苗率低且不整齐,严重制约了牡丹的产业化发展。已有研究表明,赤霉素（gibberellin,GA3）处理可以有效打破牡丹种子的上胚轴休眠,但关于GA3解除上胚轴休眠的机制还不明确。本研究以‘凤丹’牡丹种子为材料,首先基于萌发率、初萌期、幼苗生长指标和生物量等指标确定了GA3在打破种子上胚轴休眠的最佳处理浓度和处理时间,在该条件下测定了上胚轴在解除休眠过程中种子中营养物质含量、激素含量以及酶活性的变化,并对GA3最佳处理0.5 d,8 d和16 d后的‘凤丹’种子进行转录组学测序,最终筛选出了GA3处理在种子萌发过程中的差异表达基因,为揭示外源GA3打破‘凤丹’上胚轴休眠的分子机制提供了有价值的参考。主要研究结果如下:1.外源GA3处理均可打破‘凤丹’种子上胚轴休眠。与其他处理相比,250mg·L-1 GA3处理12 h后,初萌期最短（16.5 d）,发芽率最高（68.75%）,幼苗的枝长、叶柄长、苗高、主根直径以及最长根长提高明显,幼苗生物量的积累增加,打破休眠的效果最好。因此,选用250 mg·L-1 GA3溶液处理已生根种子（根长6±1 cm）12 h作为最佳处理条件,用于后续研究。2.在GA3最佳处理条件下,种子在0 d～36 d的萌发过程中营养物质含量、激素含量和酶活性均发生了显著变化。淀粉含量呈现逐渐降低趋势,可溶性糖和可溶性蛋白呈现先上升后降低的趋势,并在处理8 d后与对照组差异显著（P＜0.05）。淀粉和可溶性糖的含量变化在种子萌发0～0.5 d呈现负相关性,α-淀粉酶活性和淀粉含量呈显著负相关。外源GA3处理极显著提高了种子中总GA3的含量,在处理0.5 d时比对照组提高了19.82%;脱落酸（abscisic acid,ABA）的含量一定程度上与GA3呈现动态平衡,但其含量始终处于较低水平(2.42 ng·g-1～5.06 ng·g-1);GA3/ABA的比值显著高于对照组,与GA3含量变化趋势相似;IAA的含量始终呈现上升趋势。过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶等抗氧化酶的活性在外源GA3处理后均得到显著提升。3.基于转录组结果分析,共挖掘出19个与淀粉和蔗糖代谢通路相关的差异表达基因。外源GA3处理可显著降低淀粉和蔗糖合成途径相关基因的表达量,提高代谢途径相关基因的表达量。主要表现为SPS基因（sucrose-phosphate synthase）下调表达,SUS基因（sucrose synthase）、INV基因（invertase）、HK基因（hexokinase）和β-amy基因（beta-amylase）的表达量均呈现不同程度的上调趋势,从分子水平上加强淀粉和蔗糖的代谢活动,这与生理指标测定中淀粉和可溶性糖含量在种子休眠打破过程中下降相一致。4.基于转录组结果挖掘出42个涉及5种激素代谢通路的差异表达基因,其中与赤霉素、脱落酸、生长素、乙烯和茉莉酸合成代谢通路相关的基因分别有9个、9个、8个、10个和6个。整体而言,外源GA3处理一定程度负反馈调节‘凤丹’种子中与赤霉素、脱落酸合成代谢通路相关差异表达基因的表达。主要表现为在外源GA3处理后,与对照组相比,与赤霉素合成通路相关的KO基因（ent-kaurene oxidase）、KAO基因（ent-kaurenoic acid oxidase 2-like）和GA20-ox-like基因（gibberellin 20-oxidase-like protein）表达量显著下降,与赤霉素降解途径相关的GA2-ox-2基因（gibberellin 2 oxidase 2）上调表达,与脱落酸合成通路相关的SDR2a基因（Short-chain dehydrogenase reductase 2a）上调表达,与脱落酸降解途径相关的类ABA 8’-羟化酶3基因（Abscisic acid 8’-hydroxylase 3-like）下调表达。结合基因表达情况和生理指标测定结果进行分析,推测GA3处理组种子中处理0.5 d时总GA3含量的极显著增高可能主要来源于吸收的外源GA3,这可能也是引起种子中内源赤霉素、脱落酸合成和代谢通路负反馈调节的主要原因。外源GA3处理可促进与生长素、茉莉酸和乙烯合成相关的基因表达量上调,促进种子萌发。综上所述,250 mg·L-1 GA3处理已生根‘凤丹’种子12 h时打破休眠的效果最好,该条件可提高淀粉与蔗糖代谢途径基因的表达水平,从而促进淀粉和蔗糖的水解,为种子萌发提供物质和能量基础。同时,GA3处理也可通过反馈抑制的方式在分子水平参与调节种子中与GA3途径相关基因的表达,并在生理水平上得以体现,以解除‘凤丹’上胚轴休眠。