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目的:
探讨联合高LET重离子和微管毒素两种策略诱导肿瘤细胞死亡并抑制其增殖活性的效应与机制。
材料与方法:
以人宫颈癌HeLa细胞为研究对象,利用流式细胞术检测联合处理对细胞周期分布,有丝分裂指数,DNA双链断裂(DSB)以及细胞凋亡的影响;用免疫荧光染色法研究中心体复制,多极纺锤体及有丝分裂灾变(MC)表型;用常规染色体分析技术研究染色体畸变与不稳定性;用免疫印迹技术分析与有丝分裂进入和退出有关蛋白的表达水平;用MTT法检测细胞存活与增殖能力的变化。
结果:
1、本研究以高LET重离子(200keV/μm铁离子和50keV/μm碳离子)辐照经微管毒素nocodazole(Noco)阻滞在有丝分裂中期的HeLa细胞,同时以单纯Noco处理和单纯重离子辐照为参照进行比较,发现经Noco处理后,无论有没有引入电离辐射,细胞都在中期阻滞超过10h。中期阻滞后发生的有丝分裂滑脱只依赖微管毒素,重离子辐照并不能加速其发生。在滑脱后多倍体细胞显著增加。联合处理后,没有明显的有丝分裂后G1或G2-M期阻滞,细胞在携有DNA损伤的情况下进入后续周期进程。这种早熟进入引起了中心体额外复制以及多极纺锤体增加,导致胞质分裂失败和多倍体发生,诱导了MC。
2、在50keV/μm碳离子联合Noco的研究中,发现Noco对于干扰中心体结构具有更重要的意义。碳离子诱导的DNA损伤则在诱导MC表型时起到了更为重要的作用。
3、免疫印迹研究发现,有丝分裂滑脱的确伴随CyclinB1的快速降解。Cdc20在有丝分裂滑脱时的表达水平和CyclinB1有协同性。Cdh1表达水平持续下降无法有效执行稳定G1期的功能,细胞在携带损伤DNA的情况下早熟进入S期。所有有丝分裂相关蛋白在116h几乎都不再表达,表明联合处理组细胞的增殖能力基本消失。
4、下游中期染色体核型研究发现,联合处理后除了染色体断裂和交换外,也能观察到染色单体畸变。而且,畸变不仅在分裂后的近二倍体细胞中观察到,在四倍体细胞中也观察到,表明碳离子辐照中期细胞促进了染色体不稳定性(CIN)的发生。
5、碳离子辐照中期细胞显著促进了细胞凋亡的发生,并且也抑制了细胞的增殖活性,达到了有效杀死HeLa细胞的目的。
结论:
与单纯处理组相比,高LET重离子联合微管毒素Noco确实能破坏基因组的稳定性,有效增强HeLa细胞死亡,抑制其增殖活性。有丝分裂灾变(MC)表型的高频发生及延迟的凋亡是联合处理增强HeLa细胞死亡的重要机制。