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随着当前化石能源危机以及其引发的全球气候变化和环境污染的日益严重,对清洁环保的绿色能源开发与探索显得更为迫切。氢能作为一种能量密度大、可再生、清洁环保的绿色可替代能源受到广泛关注。在诸多产氢技术中,厌氧发酵产氢技术具有反应条件温和、反应器设计简单及可利用廉价有机废物制备等特点,使其成为氢能源和环保领域研究热点。但厌氧发酵较低的产氢效率一直是技术瓶颈,严重制约产业化发展。因此,厌氧发酵制氢对高效产氢菌的选育尤为重要,成为当前厌氧发酵制氢工业化的研究重点,目前利用基因工程和辅酶工程等新技术选育高效产氢工程菌成为研究热点方向之一。本研究以产气肠杆菌Enterobacter aerogenes CCTCC AB91102为出发菌株,该菌株具有易于培养、底物适用范围广和发酵周期短等诸多优点,使之成为具有工业化潜力的产氢菌种之一。产气肠杆菌厌氧发酵是一个相对复杂的代谢过程,对其产氢代谢的研究包括甲酸裂解途径和NADH途径。通过甲酸裂解途径的氢酶基因的同源表达,增加氢酶的表达量,从而达到提高工程菌产氢效率的目的。此外,还对其发酵条件做了优化,以进一步提高产氢量。同时,针对产气肠杆菌另一产氢途径(NADH途径)展开了代谢机理初步探索。主要研究内容和结果摘要如下:1.构建了过表达氢酶-3亚基的同源重组工程菌AB91102-hyc E和AB91102-hyc G。以产气肠杆菌E.aerogenes AB91102基因组DNA为模板,扩增得到氢酶-3大亚基(Hyc E)hyc E基因(Gen Bank No.KM096473)、膜结合蛋白(Hyc F)hyc F基因(Gen Bank No.KM096474)以及小亚基(Hyc G)hyc G基因(Gen Bank No.KM096475)。针对hyc E和hyc G两个基因成功构建了表达质粒p ET28a-Pkan-hyc E和p ET28a-Pkan-hyc G,并将表达质粒转入产气肠杆菌AB91102中,获得AB91102-hyc E和AB91102-hyc G两株高效工程菌。基因工程菌产氢特性研究结果显示,工程菌产氢效率较原始菌株分别提高11.51%和6.77%。发酵液成分及产氢贡献分析表明:基因工程菌甲酸裂解途径的产氢量分别提高了5.4%和1.9%,NADH途径的产氢量分别提高了54.8%和40.6%。该结果表明氢酶-3亚基过表达不仅可提高甲酸裂解途径产氢,而且可促进NADH途径产氢。2.优化工程菌E.aerogenes AB91102-hyc E厌氧发酵条件。首先,采用单因素优化了影响发酵的关键参数接种量、温度和初始p H,结果表明:最适接种量为10%,最适温度为35°C,最适初始p H为6.0。在单因素优化基础上,进一步运用Central Composite Design(CCD)设计实验,利用统计学软件SAS 9.0分析和预测响应值。预测最优发酵条件:接种量为11.6%,温度为34.6°C,初始p H值为6.07。厌氧发酵产氢验证实验得到的实际产氢效率为1.175 mol H2/mol葡萄糖,与模型预测值1.169mol H2/mol葡萄糖非常接近,表明预测模型的可靠性。3.考察了产气肠杆菌氢酶-3的Hyc E、Hyc F和Hyc G亚基功能。利用Red重组系统完成抗性标记基因与氢酶-3基因进行同源重组,从产气肠杆菌基因组成功分别敲除了hyc E、hyc F和hyc G基因,并消除抗性基因,获得突变菌株分别命名为AB91102-Δhyc E、AB91102-Δhyc F和AB91102-Δhyc G。厌氧恒化实验结果表明,突变菌株总NAD(H)浓度变化不大,但NADH/NAD+比值从1.06分别提高到1.39、1.45和1.41,对于葡萄糖的摄取量分别下降了47.85%、46.49%和48.95%。厌氧批次发酵实验表明,突变菌株的产氢量降至零,葡萄糖的摄取量分别下降了35.1%、34.5%和36.0%。此外,突变菌NADH途径的产氢量为零,参与NADH途径的氢酶检测不到活性,表明氢酶-3基因敲除对甲酸裂解途径和NADH途径均产生阻断或抑制的作用,是产气肠杆菌复杂产氢途径的关键酶。