目的利用目标区域捕获结合高通量测序技术筛查N OA患者相关S NV变异,通过Case-Control study进行关联研究,并初步探索致病机制,进一步揭示导致N OA的遗传学因素;构建N OA相关的S NV库,为下一阶段扩大样本量研究提供参考位点。本研究系列为最终建立能够应用于临床的N OA遗传诊断平台提供理论和实验基础,为可能涉及到进行性加重的不育患者或通过辅助生殖技术生育的不育子代提供生育力保存或遗传病因学诊断咨询依据。方法NOA组纳入自2013年9月至2014年12月因“男性不育”到吉林大学第一医院生殖中心就诊,并确诊为NOA的患者,对照组纳入自2013年9月至2014年12月到吉林省人类精子库捐精的志愿者,NOA组和对照组均需经G显带染色体核型分析和外周血Y染色体AZF微缺失检测确认无染色体异常和AZF微缺失,并进行民族等基本信息和精索静脉曲张等既往史和现病史的排查;本研究参考OMIM、GENCODE、Ref Seq、Vega Genome Browser和Pubmed等数据库,收集经动物模型研究、RNA/蛋白表达谱研究、全基因组关联研究(GWAS)和SNV统计分析研究报道的NOA相关基因,在此基础上制备针对NOA相关基因外显子区域的目标区域捕获结合高通量测序平台;本研究对NOA组患者和对照组志愿者经专业问卷调差的形式收集年龄等基本信息,采用手淫取精的方式收集精液样本用于精液常规分析和精浆生化分析,取前臂浅静脉血用于外周血血清生殖激素水平检测;本研究应用目标捕获结合高通量测序技术对NOA组患者和对照组志愿者的目标基因外显子区域进行测序,整体流程包括全基因组文库制备、目标区域捕获测序和生物信息学分析3个部分;本研究最后应用Case-Control study进行SNV与NOA关联研究并构建NOA相关SNV library为下一阶段扩大样本量验证提供参考位点,关联研究主要包括NOA组和对照组SNV筛选、NOA组和对照组次等位基因频率(MAF)对比、SNV与NOA相关性研究、SNV基因型分析、基因型与临床表型关联研究等步骤、SNV单体型分析等步骤,SNV library构建主要包括贝勒流程、对照组MAF为0条件筛选和library描述等步骤。结果1.NOA组共计纳入34例符合标准的患者,对照组共计纳入40例符合标准的受检者。2.经参考文献和公共数据库,共计纳入467个NOA相关基因,并制备了针对NOA相关基因外显子区域的目标区域捕获结合高通量测序平台。3.对NOA组患者和对照组受试者基本信息的收集和临床指标检测表明NOA组和对照组在平均年龄、身体质量指数(BMI)、精子密度、血清卵泡刺激素(FSH)水平、血清黄体生成素(LH)、血清泌乳素(PRL)水平、血清睾酮(T)水平、血清抑制素B水平、精浆果糖水平、α糖苷酶水平和精浆锌水平存在统计学差异(p<0.05),在精索静脉曲张率、精液量和血清雌二醇(E2)水平等方面无统计学差异(p>0.05)。4.目标区域捕获结合高通量测序产出大量高质量数据,Align rate≥95%(推荐参考值)的样本比例为100%、所有样本读深≥20×覆盖率介于99.9%-92%之间、所有样本Duplication rate≤20%(推荐临界值)的样本比例达到100%。5.对74例样本经测序所得共计178966例变异,65%分布在内含子区域,24%分布在外显子区域,10%分布在开放阅读框(ORF)上下游调控区域,其余1%分布于属于非调控区的基因间隔内;对74例样本经测序所得178966例变异的变异方式进行统计对比结果表明检出变异主要分为SNV和插入缺失标记(Indel)两种,检出的SNV类型包括非同义突变(nonsynonymous)、同义突变(synonymous)、无义突变(stopgain)、终止密码子丢失(stoploss)和剪接突变(splicing),检出的Indel突变类型包括移码突变(frameshift)、非移码突变(non-frameshift)和终止密码子丢失,此外检出的SNV和Indel都包含大量效果未知的变异(unknown),NOA组和对照组比较各种已知效果变异方式的检出频率差异无统计学意义(p>0.05),未知效果变异检出频率差异有统计学意义(p<0.001)。6.Case-Control study针对分布于外显子的SNV类型的变异进行研究,对74例样本经测序检出的总计178966例变异进行筛选,结果分布于外显子区域测序深度≥20×的SNV变异总计41452例,全部变异分布于2391个(种)SNV位点。7.本研究对74例样本测序检出结果中筛选出的2391个候选SNV位点在NOA组与对照组间进行等位基因频率统计对比,并同时计算各个候选SNV在NOA组和对照组中的哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE),结果显示包括BRDT c.1949C>T(rs10747493)等65个候选SNV等位基因频率在NOA组与对照组间存在统计学差异(p<0.05),其中BRDT c.1949C>T(rs10747493)等38个SNV的基因型在NOA组和对照组中的分布均符合哈迪温伯格平衡(p>0.05)。8.本研究对经NOA组和对照组间等位基因频率统计对比有统计学差异,且基因型分布符合哈迪温伯格平衡的38个SNV进行与NOA发病的关联分析,并同时以“年龄”因素为协变量进行相关性校正,结果表明KIF2C c.531A>T(rs3795713)等18个SNV经校正后与NOA相关性仍有统计学意义(p<0.05),其中MTRR c.537T>C(rs161870,OR:3.686)等5个SNV与NOA发病呈正相关,KIF2C c.531A>T(rs3795713,OR:0.291)等13个SNV与NOA发病呈负相关,所有18个SNV在HGMD数据库中均无NOA致病性报道。9.本研究对经过关联性分析得出的18个与NOA呈显著相关性的SNV的显性模型与隐性模型进行分析,并同时以“年龄”因素为协变量进行校正,结果显示17个SNV显性或隐性基因型与NOA相关。其中MTRR c.537T>C(rs161870)等10个SNV在校正后显性模型分析仍有统计学意义(p<0.05),其中MTRR c.537T>C(rs161870,OR:4.024)等3个SNV在显性模式下与NOA发病呈正相关,KIF2C c.531A>T(rs3795713,OR:0.293)等7个SNV在显性模式下与NOA发病呈负相关,TAF4B c.1815T>C(rs1677016)等7个SNV在校正后隐性模型分析有统计学意义,其中TAF4B c.1815T>C(rs1677016,OR:5.457)等2个SNV在隐性模式下与NOA发病呈正相关,HLA-DPB1 c.292A>G(rs1042140,OR:0.059)等5个SNV在隐性模式下与NOA发病呈负相关。10.本研究对SNV基因型与NOA相关临床表型进行关联研究,结果显示MTRR c.537T>C(rs161870)等8个SNV的基因型频率在不同NOA相关临床表型正常值组和异常值组间存在显著性差异。其中MTRR c.537T>C(rs161870,OR:3.231),MTRR c.1049A>G(rs162036,OR:3.231)和PIWIL1 c.1580G>A(rs1106042,OR:3.592)显性基因型与FSH高值存在正相关;ACE c.81C>T(rs4316,OR:2.858),ACE c.471A>G(rs4331,OR:2.858),ACE c.606G>A(rs4343,OR:2.858)和ACE c.1665T>C(rs4362,OR:3.771)隐性基因型与PRL高值存在正相关;PIWIL1 c.1580G>A(rs1106042)显性基因型与T低值存在正相关,与抑制素B异常存在正相关;TAF4B c.1815T>C(rs1677016,OR:3.871)隐性基因型与精浆α糖苷酶异常存在正相关。11.本研究对NOA相关SNV单体型分析结果表明,KIF2C c.531A>T(rs3795713)等5个SNV在1号染色体上形成2个单倍体block,KIF2C c.531A>T(rs3795713)等3个SNV形成block1,有2种单体型,分别为AAG和TCA,AAG在NOA组的频率显著高于对照组(83.8%vs.68.8%,p=0.033),TCA在NOA组的频率显著低于对照组(16.2%vs.31.2%,p=0.033),MAEL c.12T>C(rs2296837)等2个SNV形成block2,有3种单体型,分别为TT、CG和CT,TT在NOA组的频率显著高于对照组(86.8%vs.68.8%,p=0.009),CG在NOA组的频率显著低于对照组(13.2%vs.28.7%,p=0.022),CT在NOA组的频率和对照组相比无统计学差异(p>0.05);MTRR c.537T>C(rs161870)等2个SNV在5号染色体上形成1个单倍体block,block中有2种单体型,分别为TA和CG,TA在NOA组的频率显著低于对照组(80.9%vs.92.5%,p=0.035),CG在NOA组的频率显著高于对照组(19.1%vs.7.5%,p=0.035);HLA-DPB1 c.313A>G(rs1042151)等2个SNV在6号染色体上形成1个单倍体block,block中有3种单体型,分别为AG、GA和AA,AG在NOA组的频率显著高于对照组(94.1%vs.77.5%,p=0.005),GA在NOA组的频率显著低于对照组(4.4%vs.15%,p=0.033),AA在NOA组的频率和对照组相比无统计学差异;ACE c.81C>T(rs4316)等4个SNV在17号染色体上形成1个单倍体block,block中有3种单体型,分别为TGAC、CAGT和TGAT,TGAC在NOA组的频率显著低于对照组(51.5%vs.76.2%,p=0.002),CAGT在NOA组的频率显著高于对照组(41.2%vs.21.2%,p=0.009),TGAT在NOA组的频率和对照组相比无统计学差异(p>0.05)。12.本研究应用贝勒流程对N OA组内M AF无组间统计学差异的S NV行进一步筛选,结果表明经N OA组与对照组间等位基因频率对比差异无统计学意义的NOA组S NV变异共计62376例,最终筛选出可能致病单核苷酸突变(SNM)变异共计73例。13.本研究对贝勒流程筛选出的SNM进一步筛选对照组内等位基因频率为0的SNV,结果表明经贝勒流程筛选得到的73例候选SNM经筛选对照组内等位基因频率为0的SNM变异共计42例,分布于39个SNM位点上,位于34个基因内。14.经NOA组与对照组组间等位基因频率对比及NOA相关性研究所得52个NOA非负相关SNV位点和经贝勒流程筛选及对照组等位基因频率为0筛选所得39个SNM位点共同构成SNV library。对SNV library成分构成进行统计分析,结果表明NOA发病呈正相关SNV位点占SNV library的(5/91)5%,经NOA组与对照组等位基因频率对比有统计学差异且符合哈迪温伯格平衡,但经关联性分析与NOA发病并无显著相关性,占SNV library的(20/91)22%,经NOA组与对照组等位基因频率对比有统计学差异但不符合哈迪温伯格平衡,占SNV library的(27/91)30%,经贝勒流程筛选及对照组等位基因频率为0筛选所得SNM位点,占SNV library(39/91)43%;对SNV library位点在公共数据库的分布进行统计分析,结果显示仅能在HGMD数据库中检索到NOA相关致病性记录,在db SNP数据库中无相应SNP记录,占SNV library的(1/91)1%,仅能在db SNP数据库中检索到多态性信息,在HGMD数据库中无相应NOA相关致病性记录,占SNV library的(80/91)88%,在HGMD数据库中检索到NOA相关致病性记录,并在db SNP数据库中检索到多态性信息,占SNV library的(6/91)7%,不能在HGMD数据库中检索到NOA相关致病性记录,也不能在db SNP数据库中检索到多态性信息,占SNV library的(4/91)4%;对SNV library位点变异效果进行统计分析,结果表明突变效果为非同义突变,占SNV library的(57/91)63%,突变效果为同义突变,占SNV library的(34/91)37%。结论(1)本研究经筛查发现18个SNV与NOA存在相关性,此前均无NOA致病性报道,其中MTRR c.537T>C(rs161870)、MTRR c.1049A>G(rs162036)、PIWIL1c.1580G>A(rs1106042)、TAF4B c.1815T>C(rs1677016)和SOX10 c.927T>C(rs139884)5个SNV增加NOA致病风险;KIF2C c.531A>T(rs3795713)、KIF2C c.1345A>C(rs4342887)、KIF2C c.1500G>A(rs1140279)、MAEL c.12T>C(rs2296837)、MAEL c.121T>G(rs11578336)、HLA-DRB1 c.227T>A(rs17884945)、HLA-DPB1 c.292A>G(rs1042140)、HLA-DPB1 c.313A>G(rs1042151)、HLA-DPB1 c.315G>A(rs1042153)、ACE c.81C>T(rs4316)、ACE c.471A>G(rs4331)、ACE c.606G>A(rs4343)和ACE c.1665T>C(rs4362)13个SNV降低NOA致病风险,具有保护效应。(2)研究结果表明17个SNV显性/隐性基因型与NOA相关,其中MTRR c.537T>C(rs161870)、MTRR c.1049A>G(rs162036)和PIWIL1 c.1580G>A(rs1106042)3个SNV在显性模式下与增加NOA致病风险;KIF2C c.531A>T(rs3795713)、KIF2C c.1345A>C(rs4342887)、KIF2C c.1500G>A(rs1140279)、MAEL c.12T>C(rs2296837)、MAEL c.121T>G(rs11578336)、HLA-DPB1 c.313A>G(rs1042151)和HLA-DPB1 c.315G>A(rs1042153)7个SNV在显性模式下降低NOA致病风险,具有保护效应;TAF4B c.1815T>C(rs1677016)和SOX10 c.927T>C(rs139884)2个SNV在隐性模式下增加NOA致病风险;HLA-DPB1 c.292A>G(rs1042140)、ACE c.81C>T(rs4316)、ACE c.471A>G(rs4331)、ACE c.606G>A(rs4343)和ACE c.1665T>C(rs4362)5个SNV在隐性模式下降低NOA致病风险,具有保护效应。(3)研究结果表明8个SNV显性/隐性基因型可导致生殖激素或/和精浆生化水平改变。MTRR c.537T>C(rs161870),MTRR c.1049A>G(rs162036)和PIWIL1c.1580G>A(rs1106042)显性基因型可能通过导致FSH水平异常增高增加NOA致病风险;ACE c.81C>T(rs4316),ACE c.471A>G(rs4331),ACE c.606G>A(rs4343)和ACE c.1665T>C(rs4362)隐性基因型可能通过导致PRL水平异常增高降低NOA致病风险;PIWIL1 c.1580G>A(rs1106042)显性基因型可能通过导致T水平异常降低和抑制素B水平异常降低增加NOA致病风险;TAF4B c.1815T>C(rs1677016)隐性基因型可能通过导致精浆α糖苷酶水平异常降低增加NOA致病风险。(4)研究结果表明10个单体型与NOA相关,其中KIF2C c.531A>T(rs3795713)、KIF2C c.1345A>C(rs4342887)和KIF2C c.1500G>A(rs1140279)在1号染色体上形成NOA相关单倍体block1,MAEL c.12T>C(rs2296837)和MAEL c.121T>G(rs11578336)在1号染色体上形成NOA相关单倍体block2,block1的单倍体AAG和block2的单倍体TT是NOA发病易感因素,block1的单倍体TCA和block2的单倍体CG具有保护效应;MTRR c.537T>C(rs161870)和MTRR c.1049A>G(rs162036)在5号染色体上形成NOA相关单倍体block,其中单倍体CG是NOA发病易感因素,单倍体TA具有保护效应;HLA-DPB1 c.313A>G(rs1042151)和HLA-DPB1 c.315G>A(rs1042153)2个SNV在6号染色体上形成NOA相关单倍体block,其中单倍体AG是NOA发病易感因素,单倍体GA具有保护效应;ACE c.81C>T(rs4316)、ACE c.471A>G(rs4331)、ACE c.606G>A(rs4343)和ACE c.1665T>C(rs4362)在17号染色体上形成NOA相关单倍体block,其中单倍体CAGT是NOA发病易感因素,单倍体TGAC具有保护效应。(5)SNV library由52个NOA非负相关SNV位点和39个SNM位点共计91个SNV位点构成。