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乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenases,ALDH)是存在于肝脏线粒体中分解酒精代谢中间产物乙醛的关键酶,而参与乙醛代谢的主要是ALDH2。在东亚人群中,乙醛脱氢酶2(Aldh2)第487位氨基酸发生定点突变(谷氨酸突变为赖氨酸)的比例显著高于欧美人群。突变后的ALDH2酶活性基本丧失,使乙醛在人体内无法正常代谢而产生过度积累。携带突变基因Aldh2(E487K)的东亚人群对乙醇非常敏感,少量饮酒就会脸红和头晕,且乙醛的诱变和致癌作用又对人体有很大伤害。本研究旨在通过基因工程方法对Aldh2(E487)进行分子克隆,并利用大肠杆菌表达体系进行重组蛋白的制备。研究内容及方法如下:1、提取人体肝癌细胞的总RNA,经反转录后,以产物cDNA为模板,根据人乙醛脱氢酶2(GenBank登记编号为CR456991.1)的基因序列设计引物,引入定点突变E487K,通过PCR扩增得到目的基因。将目的基因连接至pMD19-T-simple载体中,生成构建克隆质粒pMD19-T-ALDH2(E487K),通过双酶切鉴定其连接成功。测序后进行同源对比分析,结果显示基因序列同源性为100%。用限制性内切酶EcoRI与Nde I从pMD19-T-ALDH2(E487K)中将目标基因切下,亚克隆至同样双酶切的质粒pET44b(+)中,之后,将重组质粒pET44b-ALDH2(E487K)转化入E.oli BL21(DE3)中。双酶切试验结果显示在1500 bp、5600 bp左右均有特异性条带,说明重组载体构建成功,测序结果也表明插入序列为ALDH2(E487K)。2、通过改变IPTG浓度、诱导时间和诱导温度来优化重组蛋白的表达。根据实验结果可得:IPTG浓度为0.5 mM,诱导温度为37 ℃℃,诱导4 h时表达量最大。经Western blotting检测,显示有特异反应条带,证明所表达的重组蛋白是带有His标签的预期蛋白,并以包涵体形式存在。3、使用Nj2+-NTA亲和层析柱进行重组蛋白的纯化,并通过改变平衡缓冲液中咪唑浓度对纯化条件进行优化。结果显示,平衡缓冲液中咪唑浓度为30 mM时,杂蛋白含量明显降低,得到目的蛋白总IOD值约为2192.39,目的蛋白的纯度高达98%。经过复性,测得ALDH2(E487K)蛋白浓度为 107.7 μg/mL,证明 ALDH2(E487K)蛋白经复性纯化后变为可溶状态。4、采用脱氢酶酶活测定方法测定酶的活性,得出ALDH2(E487K)酶活为0.69U/mL,约为野生型ALDH2的一半,酶活较低。对其最佳反应温度及pH进行优化,发现ALDH2(E487K)催化反应的最适温度为35℃,最适pH为8,与野生型ALDH2相差不大。另外,金属离子对ALDH2(E487K)与ALDH2酶活均有不同程度的促进作用,Mrn2+和Zn2+的催进效果更显著,但金属离子对两种酶的促进效果差距不明显。通过双倒数作图法法可算得ALDH2(E487K)和野生型ALDH2对底物乙醛的Km值分别为104.17 μM和30.45 μM,Kcat/Km分别为0.192s-1mM-1和1.17s-1mM-1。可以看出,野生型ALDH2相比于ALDH2(E487K)对底物乙醛的亲和力更好,且对乙醛的催化效率更高。此外,热稳定性实验表明,温度升高对两种酶稳定性影响均较大,50℃时ALDH2(E487K)仍有较好的稳定性,高于60℃时二者稳定性均较差。酸碱稳定性研究表明,该酶在碱性环境中的稳定性略低于ALDH2,但在酸性环境下的稳定性与野生型ALDH2基本一致。本研究利用基因工程方法,通过微生物发酵法制备了突变型乙醛脱氢酶2,并优化了其表达及纯化条件,得到了表达量和纯度都较高的重组蛋白,弥补了当前国内此课题的研究空缺,为本实验室的后续相关突变设计提供对照与理论基础,同时为乙醛脱氢酶类解酒产品的开发提供了新的思路。