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目的
采用补肾化痰方干预去卵巢大鼠，观测肠道黏膜屏障功能变化，血清及骨组织中促炎因子与抗炎因子表达，以及该方对IL-6/JAK2/STAT3和IL-2/JAK1/STAT5信号通路、CD4+T细胞亚群辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)/调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)平衡的影响，探讨补肾化痰方防治绝经后骨质疏松症的机制。
方法
6月龄雌性SD大鼠90只，按随机数字表分为假手术组(Sham)、模型组(Ovariectomized，OVX)、戊酸雌二醇组(Estradiol valerate，EV)、补肾化痰方低剂量组(OVX+BL，BL)、补肾化痰方中剂量组(OVX+BM，BM)、补肾化痰方高剂量组(OVX+BH，BH)。除Sham组外，其他组均采用手术切除卵巢，制作绝经后骨质疏松症模型。术后1周灌胃给药，OVX组和Sham组以等体积的生理盐水灌胃，1次/d，灌胃12周后取材。
实验一：运用苏木精-伊红染色，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，碱性磷酸酶染色，观察骨组织的病理形态；微计算机断层扫描技术检测大鼠骨量及骨微结构，观察骨量及骨小梁的变化。
实验二：运用苏木精-伊红染色观察结肠组织病理形态变化；采用酶联免疫吸附法检测结肠组织中白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-2、IL-10、IL-17含量；运用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测肠道紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白表达。
实验三：采用酶联免疫吸附法检血清中IL-6、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor，TNF-α)含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA的表达，免疫印迹法检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。
实验四：采用酶联免疫吸附法检测血清中IL-2、转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、STAT5mRNA的表达，免疫印迹法检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、P-JAK1、STAT5、P-STAT5蛋白表达。
实验五：采用酶联免疫吸附法检测血清中叉头框蛋白p3(Forkhead Box，Foxp3)、维甲酸相关核孤受体γt(Retinoicacid-relatedorphanreceptorγt，RORγt)、IL-10、IL-17含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17mRNA表达，免疫印迹法检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17蛋白表达。流式细胞术检测骨组织中Th17，Treg细胞数量及Th17/Treg比值。
结果
实验一：苏木精-伊红染发现，Sham组股骨组织结构完整，骨小梁丰富，脂肪细胞少。OVX组股骨组织骨微结构破坏，髓腔内出现大量空泡状脂肪细胞。EV组髓腔脂肪细胞数量减少，网状结构略微修复，结构仍不完整。BL、BM、BH组骨小梁形态结构较OVX组明显改善。破骨与成骨细胞计数：与sham组比较，OVX组破骨细胞(Osteoclast， OC)数量显著增多(P＜0.01)，成骨细胞(Osteoblast，OB)数量无统计学意义；与OVX组比较，EV、BM、BH组OC数量显著减少(P＜0.01或P＜0.05)，BL组差异无统计学意义；OB数量显著增多(P＜0.01或P＜0.05)，EV、BL组差异无统计学意义。骨微结构：与Sham组相比，OVX组中骨组织骨微结构参数BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低(P＜0.01)，Conn.D.、Tb.Sp升高(P＜0.01)；与OVX组相比，EV、BL、BM、BH组中BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高(P＜0.05，P＜0.01)，Conn.D.、Tb.Sp降低(P＜0.01，P＜0.05)。三维重建中sham组大鼠骨组织骨小梁结构较均匀，排列整齐，连接呈网状，形态较完整；OVX组骨小梁结构明显变细、断裂、变薄，且骨皮质变薄，形态结构性差，骨质疏松样改变典型。
实验二：苏木精-伊红染发现，Sham组结肠黏膜结构较完整，未见上皮细胞明显变性坏死或脱落，肠腺排列较为密集，固有层内杯状细胞丰富，形态及数量正常，未见明显炎症细胞浸润。与Sham组相比，OVX组结肠黏膜完整性受到破坏，上皮细胞变性坏死或脱落，固有层内部肠腺腺腔扩张，可见炎性细胞浸润黏膜肌层。与OVX组相比，EV、BM、BH组结肠黏膜各层次结构较为清晰，肠腺排列较规则，炎症细胞浸润减少，杯状细胞数量增加，形态改善。BL组结构改善不明显。与Sham组比较，OVX组IL-6、IL-17浓度显著升高，IL-2、IL-10浓度显著降低(P＜0.01)。与OVX组比较，EV、BM、BH组IL-6、IL-17浓度显著降低(P＜0.01)，IL-2、IL-10浓度显著升高(P＜0.01或P＜0.05)；BL组IL-6浓度降低(P＜0.05)，IL-17浓度差异无统计学意义，IL-2浓度升高(P＜0.05)，IL-10浓度差异无统计学意义。PCR及WB：与Sham组比较，OVX组Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)；与OVX组比较，BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA表达升高(P＜0.01，P＜0.05)，EV组ZO-1mRNA表达升高(P＜0.05)，BM组Claudin-1、ZO-1mRNA表达升高(P＜0.05)，EV、BM、BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组各项指标差异没有统计学意义。
实验三：与Sham比较，OVX组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量显著升高(P＜0.01)；骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著增加(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达显著增加(P＜0.01)。与OVX组比较，各干预组血清中IL-6、TNF-α含量显著降低(P＜0.01)；骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著降低(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达降低(P＜0.01或P＜0.05)。与BL组比较，BH组血清中IL-6、TNF-α含量显著降低(P＜0.01)。骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著降低(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显著降低(P＜0.01)。
实验四：与Sham比较，OVX组大鼠血清中IL-2、TGF-β1含量显著降低(P＜0.01)；骨组织中IL-2、IL-2RAIL-2RBmRNA及蛋白表达显著降低，JAK1、STAT5mRNA表达显著升高(P＜0.01)，JAK1、P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显著升高(P＜0.01)；与OVX组比较，各干预组血清中IL-2、TGF-β1含量显著升高(P＜0.01)，EV、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RBmRNA表达显著升高，JAK1、STAT5mRNA表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，BL组中仅IL-2RA差异有显著性统计学意义(P＜0.05)。EV、BL、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达升高(P＜0.01，P＜0.05)，P-JAK1、P-STAT5蛋白表达降低(P＜0.01，P＜0.05)。JAK1、STAT5蛋白差异无统计学意义。与BL组比较，BH组血清中IL-2、TGF-β1含量显著升高(P＜0.01)。BH组骨组织中IL-2、IL-2RBmRNA表达显著升高，JAK1、STAT5mRNA表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达显著升高，P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
实验五：与Sham组比较，OVX组血清中Foxp3、IL-10浓度显著降低，骨组织中Foxp3、IL-10mRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)，RORγt、IL-17mRNA及蛋白显著升高(P＜0.01)；与OVX组比较，各干预组血清中Foxp3、IL-10浓度显著升高(P＜0.01)，RORγt、IL-17浓度显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。EV、BM、BH组骨组织中Foxp3、IL-10mRNA显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组差异无统计学意义，EV、BL、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17mRNA显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。EV、BM、BH组骨组织Foxp3、IL-10蛋白表达显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组Foxp3蛋白表达升高(P＜0.05)，IL-10蛋白差异无统计学意义；EV、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17蛋白表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。BL组中差异无统计学意义。流式分析：与Sham组比较，OVX组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显著降低(P＜0.01)，CD4+IL-17A(Th17)细胞数量显著升高(P＜0.05)，Th17/Treg比值显著升高(P＜0.01)。与OVX组比较，EV、BL、BM、BH组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显著升高(P＜0.01)，CD4+IL-17A(Th17)细胞数量在EV、BM、BH组显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，在BL组差异无统计学意义；Th17/Treg比值显著降低(P＜0.01)。
结论
补肾化痰方可能通过修复肠道黏膜屏障功能，改变骨免疫环境，调节Th17/Treg平衡，双向调节骨形成与骨吸收，起到防治PMOP的作用。
采用补肾化痰方干预去卵巢大鼠，观测肠道黏膜屏障功能变化，血清及骨组织中促炎因子与抗炎因子表达，以及该方对IL-6/JAK2/STAT3和IL-2/JAK1/STAT5信号通路、CD4+T细胞亚群辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)/调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)平衡的影响，探讨补肾化痰方防治绝经后骨质疏松症的机制。
方法
6月龄雌性SD大鼠90只，按随机数字表分为假手术组(Sham)、模型组(Ovariectomized，OVX)、戊酸雌二醇组(Estradiol valerate，EV)、补肾化痰方低剂量组(OVX+BL，BL)、补肾化痰方中剂量组(OVX+BM，BM)、补肾化痰方高剂量组(OVX+BH，BH)。除Sham组外，其他组均采用手术切除卵巢，制作绝经后骨质疏松症模型。术后1周灌胃给药，OVX组和Sham组以等体积的生理盐水灌胃，1次/d，灌胃12周后取材。
实验一：运用苏木精-伊红染色，抗酒石酸酸性磷酸酶染色，碱性磷酸酶染色，观察骨组织的病理形态；微计算机断层扫描技术检测大鼠骨量及骨微结构，观察骨量及骨小梁的变化。
实验二：运用苏木精-伊红染色观察结肠组织病理形态变化；采用酶联免疫吸附法检测结肠组织中白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IL-2、IL-10、IL-17含量；运用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测肠道紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白表达。
实验三：采用酶联免疫吸附法检血清中IL-6、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor，TNF-α)含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA的表达，免疫印迹法检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。
实验四：采用酶联免疫吸附法检测血清中IL-2、转化生长因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、STAT5mRNA的表达，免疫印迹法检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、P-JAK1、STAT5、P-STAT5蛋白表达。
实验五：采用酶联免疫吸附法检测血清中叉头框蛋白p3(Forkhead Box，Foxp3)、维甲酸相关核孤受体γt(Retinoicacid-relatedorphanreceptorγt，RORγt)、IL-10、IL-17含量，运用实时荧光定量PCR检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17mRNA表达，免疫印迹法检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17蛋白表达。流式细胞术检测骨组织中Th17，Treg细胞数量及Th17/Treg比值。
结果
实验一：苏木精-伊红染发现，Sham组股骨组织结构完整，骨小梁丰富，脂肪细胞少。OVX组股骨组织骨微结构破坏，髓腔内出现大量空泡状脂肪细胞。EV组髓腔脂肪细胞数量减少，网状结构略微修复，结构仍不完整。BL、BM、BH组骨小梁形态结构较OVX组明显改善。破骨与成骨细胞计数：与sham组比较，OVX组破骨细胞(Osteoclast， OC)数量显著增多(P＜0.01)，成骨细胞(Osteoblast，OB)数量无统计学意义；与OVX组比较，EV、BM、BH组OC数量显著减少(P＜0.01或P＜0.05)，BL组差异无统计学意义；OB数量显著增多(P＜0.01或P＜0.05)，EV、BL组差异无统计学意义。骨微结构：与Sham组相比，OVX组中骨组织骨微结构参数BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低(P＜0.01)，Conn.D.、Tb.Sp升高(P＜0.01)；与OVX组相比，EV、BL、BM、BH组中BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高(P＜0.05，P＜0.01)，Conn.D.、Tb.Sp降低(P＜0.01，P＜0.05)。三维重建中sham组大鼠骨组织骨小梁结构较均匀，排列整齐，连接呈网状，形态较完整；OVX组骨小梁结构明显变细、断裂、变薄，且骨皮质变薄，形态结构性差，骨质疏松样改变典型。
实验二：苏木精-伊红染发现，Sham组结肠黏膜结构较完整，未见上皮细胞明显变性坏死或脱落，肠腺排列较为密集，固有层内杯状细胞丰富，形态及数量正常，未见明显炎症细胞浸润。与Sham组相比，OVX组结肠黏膜完整性受到破坏，上皮细胞变性坏死或脱落，固有层内部肠腺腺腔扩张，可见炎性细胞浸润黏膜肌层。与OVX组相比，EV、BM、BH组结肠黏膜各层次结构较为清晰，肠腺排列较规则，炎症细胞浸润减少，杯状细胞数量增加，形态改善。BL组结构改善不明显。与Sham组比较，OVX组IL-6、IL-17浓度显著升高，IL-2、IL-10浓度显著降低(P＜0.01)。与OVX组比较，EV、BM、BH组IL-6、IL-17浓度显著降低(P＜0.01)，IL-2、IL-10浓度显著升高(P＜0.01或P＜0.05)；BL组IL-6浓度降低(P＜0.05)，IL-17浓度差异无统计学意义，IL-2浓度升高(P＜0.05)，IL-10浓度差异无统计学意义。PCR及WB：与Sham组比较，OVX组Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)；与OVX组比较，BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1mRNA表达升高(P＜0.01，P＜0.05)，EV组ZO-1mRNA表达升高(P＜0.05)，BM组Claudin-1、ZO-1mRNA表达升高(P＜0.05)，EV、BM、BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组各项指标差异没有统计学意义。
实验三：与Sham比较，OVX组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量显著升高(P＜0.01)；骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著增加(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达显著增加(P＜0.01)。与OVX组比较，各干预组血清中IL-6、TNF-α含量显著降低(P＜0.01)；骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著降低(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达降低(P＜0.01或P＜0.05)。与BL组比较，BH组血清中IL-6、TNF-α含量显著降低(P＜0.01)。骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3mRNA表达显著降低(P＜0.01)，IL-6、IL-6R、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显著降低(P＜0.01)。
实验四：与Sham比较，OVX组大鼠血清中IL-2、TGF-β1含量显著降低(P＜0.01)；骨组织中IL-2、IL-2RAIL-2RBmRNA及蛋白表达显著降低，JAK1、STAT5mRNA表达显著升高(P＜0.01)，JAK1、P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显著升高(P＜0.01)；与OVX组比较，各干预组血清中IL-2、TGF-β1含量显著升高(P＜0.01)，EV、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RBmRNA表达显著升高，JAK1、STAT5mRNA表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，BL组中仅IL-2RA差异有显著性统计学意义(P＜0.05)。EV、BL、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达升高(P＜0.01，P＜0.05)，P-JAK1、P-STAT5蛋白表达降低(P＜0.01，P＜0.05)。JAK1、STAT5蛋白差异无统计学意义。与BL组比较，BH组血清中IL-2、TGF-β1含量显著升高(P＜0.01)。BH组骨组织中IL-2、IL-2RBmRNA表达显著升高，JAK1、STAT5mRNA表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达显著升高，P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
实验五：与Sham组比较，OVX组血清中Foxp3、IL-10浓度显著降低，骨组织中Foxp3、IL-10mRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)，RORγt、IL-17mRNA及蛋白显著升高(P＜0.01)；与OVX组比较，各干预组血清中Foxp3、IL-10浓度显著升高(P＜0.01)，RORγt、IL-17浓度显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。EV、BM、BH组骨组织中Foxp3、IL-10mRNA显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组差异无统计学意义，EV、BL、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17mRNA显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。EV、BM、BH组骨组织Foxp3、IL-10蛋白表达显著升高(P＜0.01，P＜0.05)，BL组Foxp3蛋白表达升高(P＜0.05)，IL-10蛋白差异无统计学意义；EV、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17蛋白表达显著降低(P＜0.01，P＜0.05)。BL组中差异无统计学意义。流式分析：与Sham组比较，OVX组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显著降低(P＜0.01)，CD4+IL-17A(Th17)细胞数量显著升高(P＜0.05)，Th17/Treg比值显著升高(P＜0.01)。与OVX组比较，EV、BL、BM、BH组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显著升高(P＜0.01)，CD4+IL-17A(Th17)细胞数量在EV、BM、BH组显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，在BL组差异无统计学意义；Th17/Treg比值显著降低(P＜0.01)。
结论
补肾化痰方可能通过修复肠道黏膜屏障功能，改变骨免疫环境，调节Th17/Treg平衡，双向调节骨形成与骨吸收，起到防治PMOP的作用。