里氏木霉(Trichoderma reesei)是工业生产纤维素酶的模式菌株,其外切葡聚糖酶CBH1占其分泌总纤维素酶系的60%。cbh1基因的表达受到碳源的严格调控：纤维素存在时其表达量可提高1000倍以上,而葡萄糖条件下其表达则完全被抑制,即存在葡萄糖阻遏效应(又称碳代谢抑制carbon catabolite repression, CCR)。AMPK(AMP-activated protein kinase)是一种保守的异源三聚体蛋白质激酶,存在于大多数真核细胞中,其酶活力能够被AMP上调。在酿酒酵母碳代谢抑制中AMPK通过调节转录抑制因子Mig1的活性起作用。在里氏木霉的CCR过程中与Mig1起相似作用的蛋白为Cre1。但研究表明,在多细胞的丝状真菌中AMPK的作用可能与在酵母中的有所不同。里氏木霉的AMPK可以将酵母Mig1的丝氨酸活性位点磷酸化但对自身Cre1无此作用；在Aspergillus nidulans中CreA与AMPK没有相互作用。另外,该激酶可以通过Snf1和Rgt2/Snf3系统影响葡萄糖信号感应；在转录水平影响包括转录激活因子和转录抑制因子的磷酸化、核染色质的修饰、RNA PolⅡ的活性、细胞质mRNA的稳定性、乙酰辅酶A的平衡和组蛋白的乙酰化在内的多个基因调控步骤；在转录后水平通过抑制主要的转录调节因子Gcn4的翻译从而间接在转录水平下调编码氨基酸生物合成酶基因的表达。综上所述,由于AMPK在丝状真菌CCR中的作用有别于酵母并且可以通过多种途径影响碳源代谢相关基因的转录,那么在里氏木霉中对纤维素酶基因的转录调控是否有影响?因此,本论文针对上述问题,对里氏木霉中编码其同源蛋白的基因cnrk1进行了敲除并构建了具有不同Cnrk1激酶活性的突变株,以研究该蛋白在维素酶基因诱导转录中可能的作用和机制。取得的主要成果如下：一、通过同源性验证,证明了里氏木霉Cnrk1和酿酒酵母AMPK存在功能差异,并证明蛋白C端的低保守性可能是引起这种差异的主要原因为了验证二者的同源性,首先构建了里氏木霉Cnrk1缺失菌,一方面将酵母AMPK全蛋白基因及其超活性突变体AMPKG53R的基因回补到里氏木霉Cnrk缺失菌中,在1% Avice1诱导时纤维素酶的产生并不能恢复到野生型TU6水平；另一方面将里氏木霉Cnrk1全蛋白及其通过氨基酸突变得到的一系列突变体的系列基因回补到酵母AMPK缺失菌MCY4908中也没有弥补蔗糖利用缺陷：而将里氏木霉Cnrk1-N端和酿酒酵母AMPK-C端融合回补到MCY4908中则使其恢复了蔗糖利用能力。因此我们认为里氏木霉Cnrk1和酿酒酵母AMPK1存在功能上的差异,且这种差异可能是由于蛋白C端保守性较低引起的。二、通过里氏木霉Δcnrk1突变株的表型测定证明了该基因在碳源利用、菌丝体生长、孢子存活率及纤维素酶基因转录中发挥重要功能以里氏木霉野生型TU6为出发菌株构建了Δcnrk1突变株,实验证明该菌株对包括葡萄糖在内的各种碳源的利用能力下降；显微镜观察结果显示突变株菌丝体比野生型较小；4。C存放条件下孢子的存活率大大降低；与酵母AMPK缺失表型不同的是,里氏木霉细胞壁的完整性和抗逆性等压力响应过程并没有受到影响。1% Avice1诱导条件下突变株主要的纤维素酶CBH1表达量和pNPC酶活升高,且这种升高是由于cbh1基因在转录水平的上调引起的。三、通过Cnrk1不同活性突变体的回补,证明该蛋白在里氏木霉纤维素酶基因转录中起负调控因子的作用与TU6相比,Cnrk1 G18R突变株对各种碳源的利用能力减弱,并且丧失了利用Avice1和Lactose的能力,在0.5% xylan诱导条件下可以生长但胞外蛋白浓度和木聚糖酶活与TU6相比有减弱。因此我们得出结论：Cnrk1作为负调控因子在Avice1和Lactose诱导途径中起显著作用而对Xylan诱导途径影响较小。四、通过酵母双杂交系统筛选到与里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白通过酵母双杂交系统我们筛选到13种可能与里氏木霉Cnrk1相互作用的蛋白：AMPKβ亚基,AMPKγ亚基,葡萄糖苷酶I,热休克70kd同源蛋白1,含DDHD结构域的嗜酸性磷酸酶A1,一种DUF 4098超家族的未知蛋白,C3H1型锌指蛋白,一种氧化还原酶,隶属39家族糖基转移酶家族的甘露糖基转移酶,60S核糖体蛋白,核苷酸切除修复蛋白RAD16,L12,L11家族的40S核糖体蛋白S2和一种未知功能蛋白。这为进一步研究Cnrk1在里氏木霉纤维素酶诱导调控中的功能奠定了基础。