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MicroRNAs,简称miRNAs,是一类广泛存在于真核生物中,长约19~24个核苷酸的小分子单链非编码RNA。miRNAs在各个物种间具有高度的保守性,可在转录后水平对基因表达进行调节。研究表明miRNAs广泛参与发育、造血、器官形成、病毒防御、脂肪代谢、细胞增殖和凋亡等过程的调控,与生物的生长、发育以及与多种疾病的发生发展进程密切相关。miRNAs的表达具有组织和发育阶段特异性,并且这些组织特异表达的miRNAs在维持组织器官正常功能中发挥着十分重要的调控作用。而目前有关肾脏特异性表达的miRNAs还没有明确的报道,因此本研究首先通过Solexa技术分析和筛选出肾脏特异性表达miRNAs,并且进一步对肾脏特异性miRNAs可能在肾脏中的作用进行研究,从而更好的阐述miRNAs在肾脏中的功能。研究一:肾脏特异性microRNA的鉴定及其功能预测分析目的:应用Solexa技术分析和筛选出肾脏特异性表达microRNA (miRNA),明确肾脏特异性表达miRNAs在肾脏中的表达分布,同时利用生物信息学技术预测特异表达miRNAs的靶基因并对其功能进行初步分析,探讨特异表达miRNAs在肾脏中的功能。方法:选取8周大C57/BL6雄性小鼠,取其全身11个组织器官,提取总RNA并从中分离出小分子量RNA进行Solexa测序,筛选出相较其他组织器官,在肾脏中表达最为特异的miRNAs,并利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术对筛选出的肾脏特异性表达miRNAs进行进一步验证;然后,利用原位杂交技术对miR-196a/b在人和小鼠肾脏中的表达分布进行检测,为了进一步明确niR-196a/b在肾小球和肾小管间质间的表达差异,用qRT-PCR的方法对miR-196a/b分别在人和小鼠肾脏肾小球和肾小管的相对表达量进行了检测;最后,通过生物信息学技术对miR-196a/b进行靶基因预测,并对交集的基因集合分别进行GO(gene ontology)富集分析和KEGG通路分析。结果:(1) Solexa测序结果显示在正常小鼠中miR-196a和miR-196b在肾脏中最特异性高表达。qRT-PCR验证了miR-196a和miR-196b在小鼠11个组织器官中的表达分布情况,定量结果与测序结果相一致。(2)原位杂交结果表明miR-196a/b在人和小鼠肾脏中表达分布都十分广泛,在肾小球和肾小管中都可检测到强信号;qRT-PCR检测肾小球和肾小管间质中miR-196a/b相对表达量的结果进一步表明miR-196a/b表达的广泛性,并且miR-196a/b在肾小球中的表达量都较高于肾小管间质。(3) TargetScan6.2和PicTar两个软件预测到交集靶基因74个。GO富集分析显示miR-196a/b的预测靶基因集合显著富集在血小板源生长因子结合活性、转录调控活性、细胞外基质的结构组成等分子功能上并参与调控代谢、发育等生物学过程(P<0.01)。信号转导通路显著富集于促性腺激素释放激素信号通路、细胞外基质受体相互作用等多个信号通路和脑胶质瘤、前列腺癌等疾病通路中(P<0.05)。结论:miR-196a/b在肾脏中特异性高表达并在肾脏中广泛分布,其靶基因功能广泛,与细胞代谢、生长发育等密切相关。这些结果为进一步研究miR-196a/b在肾脏生长发育和疾病调控中的作用奠定了基础。研究二:肾脏特异性miRNA196a/b在肾纤维化中的功能研究目的:研究小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)致肾间质纤维化模型中miR-196a/b的表达变化,并深入探讨其对肾脏纤维化的影响及其作用的可能的分子机制,以揭示干预肾纤维化的新的作用靶点。方法:为了研究miR-196a/b在肾纤维化中的作用,首先,选用8周大C57/BL6雄性小鼠15只,随机等分为3组:假手术组,UUO造模3d组以及UUO造模7d组。各组小鼠分别在相应时间点处死,取其左肾,采用Masson染色法评价各组肾间质病变程度,采用qRT-PCR法检测各组小鼠肾组织miR-196a/b的表达变化。随后,通过大体积高动力静脉注射(HDS)的方法在UUO小鼠的肾组织中过表达miR-196a/b,利用qRT-PCR检测各组小鼠肾miR-196a/b水平,为了检测过表达miR-196a/b后对小鼠肾纤维化影响,我们用Masson染色的方法对各组小鼠肾纤维化水平进行了评估。为了进一步研究miR-196a/b参与调控肾纤维化可能的分子机制,通过靶点预测,我们发现与肾纤维化有关的TGFβR2型受体(TGFβR2)以及Ⅰ型胶原α1链(COLA1)和Ⅰ型胶原α2链(COLA2) mRNA的3’UTR中都含有miR-196a/b的结合位点,随后我们通过荧光素酶报告实验对这些靶点进行了验证。为了明确miR-196a/b对TGFβ/Smad信号通路的影响,通过抑制人近端肾小管上皮细胞(HK2)中miR-196a/b的表达,我们检测了TGFβR2和COLI以及SMAD相关蛋白水平的表达变化。为了对miR-196a/b对肾纤维化的调控作用进行更进一步的验证,在体内实验中我们又用免疫组化和Western的方法对各组小鼠肾组织肾纤维化相关蛋白水平进行了检测。结果:(1)miR-196a/b的表达水平随着UUO小鼠肾纤维化程度的加深而逐渐下降。(2) miR-196a/b对UUO小鼠肾纤维化具有保护作用:Masson染色结果表明过表达miR-196a/b后可以改善UUO小鼠的肾纤维化水平;(3)荧光素酶报告实验证明miR-196a/b可以通过与TGFβR2、COLA1和COLIA2 mRNA3’UTR的靶点序列结合,抑制TGFβR2与COLI的表达;(4)抑制HK2细胞miR-196a/b的表达可以上调TGFβR2与COLI的蛋白表达并且可以升高SMAD2和SMAD3的磷酸化水平;(5)体内实验的Western和免疫组化的结果也表明过表达miR-196a/b后TGFβRⅡ、α-SMA以及COLI的蛋白升高水平明显低于UUO造模组。结论:我们的研究结果首次表明,肾脏特异性miR-196a/b可以通过下调TGFβR2和COLI的表达抑制肾纤维化的进展,通过过表达miR-196a/b维持肾内miR-196a/b的表达水平为将来治疗肾纤维化疾病提供了一种潜在的可能。