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研究背景氯吡格雷是一种口服的抑制二磷酸腺苷(ADP)受体的噻吩并吡啶类抗血小板药物,广泛应用于包括急性冠脉综合症,经皮冠状动脉介入治疗和中风等的心血管疾病。由于氯吡格雷疗效的显著个体化差异,据统计,多达30%的患者未能达到预期药效。氯吡格雷抵抗被视为主要原因,包括由于氯吡格雷代谢过程中涉及药物代谢酶的基因多态性。同时,氯吡格雷抵抗也是诊治高风险心血管病人时的主要考量之一,尤其是接受急性冠脉综合征治疗的病患。CYP2C19的基因多态性对于氯吡格雷活性代谢物的生成起着至关重要的作用,并被认为是氯吡格雷药效学与药动学个体化差异的主要原因之一。美国食品药品监督管理局也指出,在给予氯吡格雷治疗前,最好先进行CYP2C19的基因型分析。除了基因多态性的因素外,非基因型因素也可能导致氯吡格雷疗效的显著个体化差异。所以,最好制定个体化给药方案,尤其是对于可能会有影响氯吡格雷疗效的基因型或非基因型因素的服药患者。由于近85%的原药被酯酶水解成氯吡格雷酸(SR26334),并且活性代谢物不易测定,对于氯吡格雷的药动学与药效学特性主要通过氯吡格雷酸进行研究。通过定量氯吡格雷酸血药浓度,进行氯吡格雷服药患者的治疗药物监测和表征氯吡格雷抗血小板效应。研究目的本研究的目的有：1.建立快速、准确、可靠的CYP2C19基因常见突变分型方法；2.测定CYP2C19基因常见多态性位点*2,*3与*17在服用氯吡格雷患者中的突变频率；3.建立氯吡格雷酸在人血浆中的血药浓度检测方法；4.研究遗传和非遗传因素对氯吡格雷酸血药浓度的影响。研究方法2011年11月至2012年6月期间,共150名无血缘关系的各民族病人(汉族,维吾尔族,蒙古族,乌孜别克族和锡伯族等)参加了本研究。所有病例均为服用氯吡格雷的患者(年龄在18岁以上)。所有受试者血样采集于上海交通大学附属新华医院与新疆医科大学第一附属医院。同时记录患者的性别、民族、年龄、体重、身高、是否高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、高血脂、甲亢以及服用氯吡格雷剂量。采集每位受试者3mL血样(肝素抗凝),用于之后的基因分型工作与氯吡格雷酸血药浓度测定,并准确记录服药与采血时间。同时,本研究建立了检测CYP2C19*2,*3与*17位点基因型的引物特异性PCR方法,以此为基础测定这三个位点在服用氯吡格雷患者中的基因突变频率。对于研究人群DNA的提取方法,我们采用酚氯仿法提取DNA。根据CYP2C19基因型,患者可分为3利类型：快代谢型(CYP2C19*1/*1)、中速代谢型(CYP2C19*1/*2.CYP2C19*1/*3)及慢代谢型(CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3、 CYP2C19*2/*3)参考文献,在实验室条件下建立HPLC-UV方法用以分析氯吡格雷用药后的氯吡格雷酸血药浓度。采用硫酸锌溶液蛋白沉淀法处理血样,以乙腈：水(磷酸调PH至3.17)(35：65)为流动相,使用岛津ODS-SP(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流速调整为1mL/min。并进行方法学确证,包括方法的专属性、灵敏度和回收率、稳定性、准确度和精密度。本研究拟采用逐步回归分析法综合分析患者的基因多态性、性别、民族、年龄、体重、身高、是否高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、高血脂、甲亢以及服用氯吡格雷剂量等多种因素对氯吡格雷酸血药浓度的影响。影响因素入选和剔除的统计学显著性水平均取0.05。研究结果CYP2C19*2,*3与*17突变型等位基因在服用氯吡格雷患者中的频率分别为29%,3%和0%。CYP2C19代谢类型分布显示68位患者(45.33%)为快代谢,68位患者(45.33%)为中速代谢,14位患者(9.33%)为慢代谢。采用HPLC-UV法测定人血浆样品中的氯吡格雷酸的浓度。以噻氯吡啶为内标,经200μL硫酸锌沉淀蛋白,离心取上清,样品检测以乙腈：水(磷酸调PH至3.17)(35：65)为流动相,流速为1mL/min,以岛津ODS-SP(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱进行分离。氯吡格雷酸的线性范围为100-10,000ng/mL。本方法专属性好,准确,快速,符合方法学考证的要求。经逐步回归分析,影响服用氯吡格雷患者氯吡格雷酸血药浓度的显著性因素由大到小依次为采血时间、吸烟、患者CYP2C19代谢类型、剂量。患者的性别、民族、年龄、体重、身高、是否高血压、糖尿病、饮酒、高血脂和甲亢,由于与氯吡格雷酸血药浓度的相关性不显著(P>0.05)而被排除。最终回归方程能够解释所研究患者群体中,氯吡格雷酸血药浓度个体差异情况的63.1%,方程为ln(Y)=6.657-0.085(采血时间)-0.382(吸烟)+0.251(患者CYP2C19代谢类型)+0.002(剂量)。结论我们首次研究了在中国服用氯吡格雷人群中CYP2C19基因多态性与非遗传因素对于氯吡格雷酸血药浓度的影响程度。采血时间、是否吸烟、CYP2C19基因多态性以及氯吡格雷服用剂量会对氯吡格雷酸血药浓度产生显著影响。希望在获取模型所需患者实际数据后,所建立的模型会对药物治疗监测和氯吡格雷剂量调整提供更进一步的借鉴指导作用。