PMSF对TOCP诱发OPIDN过程中母鸡神经系统内能量状态变化的影响

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目的建立磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)诱导迟发性神经毒性(organophosphorus easter-induced delayed neurotoxicity,OPIDN)及受苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)保护的动物模型,利用萤光素酶生物发光法(firefly luciferase bioluminescence,FLB)测定成年罗曼母鸡中枢神经系统(central nervous system,CNS)和周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的含量,利用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)同时测定实验动物CNS和PNS中三种腺苷酸的含量并计算相应的能荷(energy charge,EC)值。通过研究提前应用PMSF对母鸡在TOCP诱发OPIDN过程中神经系统内能量状态变化的影响,进一步探讨TOCP诱发OPIDN的分子机制。方法1建立TOCP诱发OPIDN及受PMSF保护的的动物模型:成年罗曼母鸡80只,随机分为TOCP组(n=40)及PMSF+TOCP组(n=40),每组又随机分为染毒后d0、d5、d10、d15和d21组(n=8),其中TOCP组的d0组为正常对照组。PMSF+TOCP组40只动物,一次sc 60 mg/kg PMSF(溶于DMSO);20h后,两个d0组以外的其它64只实验动物,一次po 750 mg/kg TOCP。在染毒后相应的时间点处理各组动物。2观察实验动物OPIDN症状:密切观察实验动物染毒前后一般状况的变化,每隔4d测量体重,每天观察其OPIDN症状并按8级评分标准进行评价。3测定实验动物神经组织中ATP的含量:利用FLB检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP含量。4测定实验动物神经组织中三种腺苷酸的含量并计算EC值:利用HPLC检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP、ADP及AMP含量,并计算相应的EC值以进一步反映神经组织中的能量状态。结果1实验动物体重的变化TOCP组动物的体重,与正常对照组相比,染毒后随着时间进展有逐渐降低的趋势,其中染毒后d21降低了23.63%(P<0.01)。PMSF+TOCP组动物的体重,与其d0组相比,染毒后各个时间点均有降低但不具有统计学意义,其中以染毒后d5降低的幅度最大,为4.28%(P>0.05)。2实验动物OPIDN症状的进展TOCP组动物在染毒后d5出现间或的双腿运动轻微不协调,d7出现明显的双腿运动中度不协调,d9出现严重的、频发的站立和行走困难;之后OPIDN症状进展迅速,从染毒后d12开始,动物出现双腿实质性至完全性的瘫痪,d21所有动物完全瘫痪。PMSF+TOCP组动物染毒后,与TOCP组动物相比,OPIDN症状出现明显延迟且进展相对缓慢:动物从染毒后d11开始出现间或的双腿运动轻微不协调,至d21也未出现双腿实质性的瘫痪。3 FLB检测实验动物神经组织中ATP含量的变化3.1大脑组织中ATP含量的变化TOCP组动物大脑组织中ATP含量,与正常对照组相比,染毒后d5、d10均有升高,其中染毒后d5升高了46.14%(P<0.01);d15、d21分别降低了20.67%(P<0.01)、26.57%(P<0.01)。PMSF+TOCP组d0组动物大脑组织中ATP含量,与正常对照组相比,升高了18.09%(P>0.05)。PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP含量,与其d0组相比,染毒后d5升高了86.88%(P<0.01);d10、d15、d21均有降低,其中d15、d21分别降低了32.40%(P<0.01)、33.33%(P<0.01)。3.2小脑组织中ATP含量的变化TOCP组动物小脑组织中ATP含量,与正常对照组相比,染毒后d5、d10分别升高了86.75%(P<0.01)、27.49%(P<0.05):d15、d21均有降低,其中d21降低了24.18%(P<0.05)。PMSF+TOCP组d0组动物小脑组织中ATP含量,与正常对照组相比,升高了26.59%(P<0.01)。PMSF+TOCP组动物小脑组织中ATP含量,与其d0组相比,染毒后d5、d10分别升高了59.45%(P<0.01)、24.23%(P<0.01);d15、d21分别降低了24.03%(P<0.01)、33.28%(P<0.01)。3.3脊髓组织中ATP含量的变化TOCP组动物脊髓组织中ATP含量,与正常对照组相比,染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d5、d10、d15分别升高了32.09%、38.48%、79.64%(均为P<0.01)。PMSF+TOCP组d0组动物脊髓组织中ATP含量,与正常对照组相比,降低了4.55%(P>0.05)。PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP含量,与其d0组相比,染毒后d5、d10、d15均有升高,其中d10、d15分别升高了37.53%(P<0.01)及13.06%(P<0.05);d21降低了16.30%(P<0.01)。3.4坐骨神经组织中ATP含量的变化TOCP组动物坐骨神经组织中ATP含量,与正常对照组相比,染毒后d5升高了161.53%(P<0.01),d10、d15、d21分别降低了42.56%、36.53%、41.97%(均为P<0.01)。PMSF+TOCP组d0组动物坐骨神经组织中ATP含量,与正常对照组相比,升高了325.26%(P<0.01)。PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中ATP含量,与其d0组相比,染毒后d5、d10、d15、d21分别降低了84.24%、89.77%、86.69%、91.39%(均为P<0.01)。3.5胫腓神经组织中ATP含量的变化TOCP组动物胫腓神经组织中ATP含量,与正常对照组相比,染毒后d5、d10、d15均有升高,分别升高了55.93%、29.20%、16.14%(均为P<0.01);d21降低了64.60%(P<0.01)。PMSF+TOCP组d0组动物胫腓神经组织中ATP含量,与正常对照组相比,升高了31.35%(P<0.01)。PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中ATP含量,与其d0组相比,染毒后d5、d10、d15、d21分别降低了54.11%、46.38%、63.81%、75.80%(均为P<0.01)。4 HPLC检测动物神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.1大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.1.1 TOCP组动物大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比,该组动物大脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10均有升高,其中d5升高了20.62%(P<0.01),d15、d21分别降低了15.50%(P<0.01)、17.96%(P<0.01);ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d5升高了18.73%(P<0.01);AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中染毒后d15、d21分别升高了14.67%(P<0.01)、21.60%(P<0.01);EC值在染毒后d5、d10均有升高,其中d5升高了11.24%(P<0.01),d15、d21分别降低了9.86%(P<0.01)、17.28%(P<0.01)。4.1.2 PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物大脑组织中的ATP含量、ADP含量、AMP含量以及EC值,与正常对照组相比,均有升高,其中ADP含量升高了10.40%(P<0.01)。与其d0组相比,PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP含量在染毒后d5升高了51.67%(P<0.01),d10、d15、d21均有降低,其中d15、d21分别降低了18.41%(P<0.01)、18.72%(P<0.01);ADP含量在染毒后d5、d10均有升高,其中d5升高了23.81%(P<0.01),d15、d21分别降低了13.08%(P<0.01)、13.34%(P<0.01);AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d15、d21分别升高了4.54%(P<0.01)、7.37%(P<0.01);EC值在染毒后d5升高了22.09%(P<0.01),d10、d15、d21均有降低,其中d15、d21分别降低了13.84%(P<0.01)、16.64%(P<0.01)。4.2小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.2.1 TOCP组动物小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比,TOCP组动物小脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10分别升高了76.95%(P<0.01)、20.36%(P<0.05),d15、d21均有降低,其中d21降低了20.49%(P<0.05);ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d5、d10、d15分别升高了19.31%(P<0.01)、18.05%(P<0.01)、10.31%(P<0.05);AMP含量在染毒后d5、d10均稍有降低,d15、d21均有升高,其中d21升高了10.11%(P<0.01);EC值在染毒后d5、d10、d15均有升高,其中d5、d10分别升高了27.37%(P<0.01)、12.31%(P<0.01),d21降低了10.16%(P<0.01)。4.2.2 PMSF+TOCP组动物小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物小脑组织中ATP含量、AMP含量以及EC值,与正常对照组相比,均有升高,其中ATP含量升高了27.04%(P<0.01),而ADP含量比正常对照组稍有降低。与其d0组相比,PMSF+TOCP组动物小脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10分别升高了45.98%(P<0.01)、23.80%(P<0.01),d15、d21分别降低了21.75%(P<0.01)、33.89%(P<0.01);ADP含量在染毒后d5、d10分别升高了17.37%(P<0.01)、10.24%(P<0.01),d15、d21均稍有降低(P>0.05);AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有降低,其中d5、d10、d15、分别降低了8.87%(P<0.01)、6.37%(P<0.05)、3.08%(P<0.05);EC值在染毒后d5、d10分别升高了24.59%(P<0.01)、14.62%(P<0.01),d15、d21均有降低,其中d21降低了10.73%(P<0.01)。4.3脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.3.1 TOCP组动物脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比,TOCP组动物脊髓组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d5、d10、d15分别升高了32.45%、42.89%、87.10%(均为P<0.01);ADP含量在染毒各个时间点并没有出现显著的差异(P>0.05),但染毒后d5、d15、d21均稍有升高,而d10稍有降低;AMP含量在染毒后d5、d10、d15均有降低,其中d10、d15分别降低了13.15%(P<0.05)及27.87%(P<0.01),d21稍有升高(P>0.05);EC值,在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高,其中d5、d10、d15分别升高了13.61%、16.73%、32.56%(均为P<0.01)。4.3.2 PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物脊髓组织中ATP含量、ADP含量以及EC值,与正常对照组相比,均稍有降低了(P>0.05),AMP含量比正常对照组稍有升高(P>0.05)。与其d0组相比,PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP含量在染毒后d5、d10、d15均有升高,其中d10、d15分别升高了35.81%(P<0.01)及15.24%(P<0.01),d21降低了12.90%(P<0.01);ADP含量在染毒后d5稍有升高(P>0.05),d10、d15 d21均有降低,其中d10降低了7.13%(P<0.05);AMP含量在染毒后d5、d10、d15均有降低,其中d10降低了13.99%(P<0.05),d21升高了18.52%(P<0.05);EC值在染毒后d5、d10、d15均有升高,其中d10升高了15.66%(P<0.01),d21降低了10.77%(P<0.05)。4.4坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.4.1 TOCP组动物坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比,TOCP组动物坐骨神经组织中的ATP含量在染毒后d5升高了130.24%(P<0.01),d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了30.65%、28.31%、30.15%;ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21分别升高了121.74%(P<0.01)、3.35%(P<0.05)、32.11%(P<0.01)、31.57%(P<0.01);AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高(P<0.01),分别升高了96.16%、72.07%、130.61%、127.09%;EC值在染毒后d5升高了8.34%(P<0.01),d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了36.10%、41.38%、41.15%。4.4.2 PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物坐骨神经组织中ATP含量、ADP含量、AMP含量以及EC值,与正常对照组相比,均有显著升高(P<0.01),分别升高了347.90%、153.70%、70.88%、47.15%。与其d0组相比,PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了82.87%、87.22%、84.55%、87.14%;ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了43.19%、52.17%、46.78%、43.94%;AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高(P<0.01),分别升高了27.65%、33.24%、53.99%、101.54%;EC值在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了56.00%、63.37%、63.78%、70.87%。4.5胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4.5.1 TOCP组动物胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比,TOCP组动物胫腓神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15均有显著升高(P<0.01),分别升高了47.49%、23.42%、14.32%,d21降低了44.63%(P<0.01);ADP含量在染毒后d5、d10、d15分别升高了30.96%(P<0.01)、9.80%(P<0.01)、4.60%(P<0.05),d21降低了33.35%(P<0.01);AMP含量在染毒后d5、d10、d21均有升高,其中d5、d21分别升高了12.67%(P<0.01)、17.96%(P<0.01),d15稍有降低;EC值在染毒后d5、d10、d15均有显著升高(P<0.01),分别升高了13.60%、7.50%、6.47%,d21降低了36.66%(P<0.01)。4.5.2 PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物胫腓神经组织中ATP含量及EC值,与正常对照组相比,分别升高了5.16%(P<0.01)、6.81%(P<0.01),ADP含量及AMP含量比正常对照组分别降低了6.05%(P<0.01)、10.96%(P<0.01)。与其d0组相比,PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了34.01%、42.82%、39.08%、49.72%;ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了11.25%、12.05%、17.01%、27.39%;AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高(P<0.01),分别升高了13.71%、20.25%、22.09%、40.90%;EC值在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低(P<0.01),分别降低了21.67%、27.56%、29.26%、43.45%。结论1单独给母鸡染TOCP能够导致动物在表现出明显的OPIDN症状之前,其神经系统的ATP含量及EC值即发生显著的升高,但在本次实验观察终点即当动物完全瘫痪时均有不同程度的降低,且以PNS中降低的幅度为最大。2提前给母鸡应用PMSF能够延迟由TOCP诱发的OPIDN症状的出现并减慢其进展,同时能够改变动物染毒后其神经系统内尤其是PNS内ATP含量及EC值的变化程度和变化趋势。3单独给母鸡应用PMSF,可以显著提高动物PNS内的ATP含量及EC值,但受PMSF保护的动物在染TOCP d5其PNS内的ATP含量及EC值即出现显著的降低,且这种低的能量水平一直持续到本次实验观察终点。4单独染TOCP所导致的在染毒后d5母鸡神经系统内ATP含量及EC值所出现的显著性升高可能是其所致OPIDN症状出现的一个重要预示,也可能TOCP诱发OPIDN过程中其它病理变化出现的原因。提前给动物应用PMSF可能正是通过阻止染TOCP后d5动物PNS内这种能量水平的暂时升高而对动物起到保护作用。
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