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研究背景胆管癌是起源于肝管上皮细胞的恶性肿瘤,其发病率在肝胆恶性肿瘤中位居第二位,仅次于肝细胞癌。胆管癌根据其发病部位分为:肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌,而其中肝门部胆管癌最常见。肝门部胆管癌(HCCA)是指发生于肝总管、左右肝管及其汇合部的粘膜上皮恶性肿瘤,近年其在亚洲国家发病率逐年上升。外科手术根治切除肿瘤是其目前最佳治疗方式,但因HCCA发病隐匿、解剖部位特殊、肿瘤早期易发生转移,导致其手术切除率低、术后复发率高。而HCCA对放化疗敏感性低,晚期病人多缺乏有效治疗方法。因此,探索肝门胆管癌发生发展过程中起关键作用的分子,寻找新的分子治疗靶点,对于改善肝门部胆管癌患者的预后具有重要意义。肿瘤的发生和发展与细胞周期调控失常及凋亡抑制关系密切。细胞周期蛋白依赖性激酶在细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的调控下,维持细胞周期运行动力。而这些调控因子之间相互促进、彼此抑制的复杂调控网络一旦出现异常,正负调节因子之间失衡就会导致肿瘤细胞无限增殖。而细胞增殖不但与周期失调、增殖失控、分化异常有关,凋亡的抑制也起重要作用。癌基因的突变常导致其调控的相应凋亡抑制基因或凋亡活化基因异常表达,细胞调查程序发生障碍,细胞进入恶性增殖状态。亲病毒整合位点基因 EVI1(ecotropic virus integration site-1),是定位于人类染色体3q26上的一种癌基因,它作为一个逆转录病毒结合位点,最早在AKXD鼠髓系恶性肿瘤DNA中发现,其编码的蛋白是带有锌指结构域的转录因子,在正常组织发育、分化和肿瘤发生中起重要作用。近些年研究发现,EVI1不仅与血液系统恶性肿瘤的发生发展关系密切,而且在其他实体恶性肿瘤中也起着重要作用。例如,在乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤中EVI1表达明显升高,而且与患者的不良预后呈负相关。在这些肿瘤的研究中,发现EVI1能够通过调控细胞周期、抑制细胞凋亡从而促进肿瘤细胞生长,并可增强肿瘤细胞侵袭能力。然而目前,国内外还没有EVI1在肝门部胆管癌中表达及与HCCA生物学行为关系的研究报告。PTEN(phosphatase and tensin homolog gene on chromosome 10)是目前已知人类癌症中最常见的突变基因之一。研究证实它对维持正常细胞分化尤为重要,而PTEN缺失会导致细胞增殖、凋亡抑制、细胞迁移增强。在大多数实体肿瘤中观察到PTEN的表达是下降的,而目前PTEN在肝门部胆管癌组织中表达情况未见报道。研究目的本研究拟探索EVI1在肝门部胆管癌组织中的表达情况,并分析肝门部胆管癌组织中EVI1的表达水平与临床病理参数的关系及其与患者生存预后的相关性,探索其临床潜在应用价值。通过敲减与过表达技术,在影响EVI1的表达后检测EVI1对肝门部胆管癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和侵袭迁移等恶性生物学行为的影响。实验进一步探索了 EVI1调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡等可能的分子机制,为探索EVI1能否作为肝门部胆管癌诊断预后的新标志物及是否可成为肝门部胆管癌新的治疗靶点提供理论依据。研究方法本研究分三部分实验进行,分别研究EVI1在肝门部胆管癌的表达情况及临床价值,EVI1对肝门部胆管癌细胞生物学功能的影响及其调控癌细胞生物学功能的潜在分子机制。1、EVI1在肝门部胆管癌的表达情况及临床价值:通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法分别检测新鲜肝门部胆管癌及其配对癌旁组织的EVI1的mRNA和蛋白表达水平。通过构建114例肝门部胆管癌患者的组织芯片,分析EVI1与肝门部胆管癌患者各临床病理参数之间的相关性,并绘制肝门部胆管癌患者的生存曲线。采用Cox单因素及多因素生存分析,筛选对HCCA患者有预后意义的影响因素。2、EVI1对肝门部胆管癌细胞生物学功能的影响:实时荧光定量PCR及免疫印迹法筛选EVI1在各胆管癌细胞系中表达水平,同时筛选出高表达和低表达EVI1的肝门部胆管癌细胞株。CCK8实验、克隆形成实验和EdU实验检测敲低及过表达EVI1后对肝门部胆管癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测EVI1对HCCA细胞周期的影响;流式细胞术和TUNEL法检测EVI1对HCCA细胞凋亡的影响;细胞划痕实验和Transwell实验检查EVI1对HCCA细胞迁移、侵袭能力的影响。应用敲低EVI1的QBC939细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察EVI1对HCCA细胞在体内增殖的影响。3、EVI1调控细胞增殖、凋亡的潜在分子机制:实时荧光定量PCR检测新鲜肝门部胆管癌组织中PTEN和EVI1的mRNA表达水平,并对两者表达结果进行线性相关与线性回归分析;免疫组织化学染色检测组织芯片中HCCA患者PTEN和EVI1的蛋白表达水平,并对两者H-Score评分进行线性相关与线性回归分析。采用免疫印迹法及补救实验明确EVI1与PTEN及其下游调控的AKT通路之间相互作用关系,进一步阐明EVI1调控细胞生物学功能的潜在机制。研究结果1、在肝门部胆管癌组织中EVI1高表达,其表达水平与肿瘤的组织分化、肿瘤大小和患者的生存预后显著相关。EVI1高表达是肝门部胆管癌生存预后较差的一个独立影响因素。2、体外实验证实EVI1在肝门部胆管癌发生发展中发挥作用。敲低或过表达EVI1的表达可抑制或促进肝门部胆管癌细胞的增殖。敲低EVI1的表达可抑制肝门部胆管癌细胞的迁移、侵袭。EVI1对细胞增殖的影响可能是通过影响细胞周期、调控细胞凋亡来实行。体内实验证实敲低EVI1表达可以抑制肝门部胆管癌肿瘤的生长。3、EVI1通过抑制PTEN调控PI3K/AKT通路活性,促进AKT磷酸化,进而影响肝门部胆管癌细胞的增殖及凋亡。PTEN/PI3K/AKT信号通路参与了EVI1介导的肝门部胆管癌细胞增殖、凋亡。结论及意义1、首次发现EVI1在肝门部胆管癌组织中高表达且与患者不良预后相关。2、EVI1在肝门部胆管癌中通过抑制PTEN调控PI3K/AKT通路活性,促进p-AKT表达,体外促进细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,并在体内促进肿瘤生长。