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目的：建立鼻黏膜外胚层间充质干细胞(Ectomesenchymal stemcells,ECTO-MSCs)的体外培养方法,探讨该细胞的干细胞特性(Stemness)和分化潜能。为临床应用组织工程治疗骨和神经组织损伤提供可行性研究资料。
方法：⑴取出成年大鼠的部分鼻中隔(包括两侧全层黏膜)经4％多聚甲醛固定24h后,冰冻切片。用Nestin和CD44抗体进行免疫荧光染色后观察ECTO-MSCs在黏膜内的分布特征。⑵自成年大鼠鼻中隔活体剪取部分鼻黏膜制成细胞悬液,用含10％胎牛血清的DMEM／F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。应用差速贴壁和连续传代培养技术,自鼻黏膜混合细胞中自然纯化并扩增ECTO-MSCs,并用干细胞标志蛋白Nestin,CD133,CD44,Vimentin抗体,在免疫荧光染色和蛋白免疫印迹的辅助下,鉴定纯化后ECTO-MSCs的干细胞特性。⑶分别用成骨诱导培养基(含地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠)及神经诱导培养基(Neurobasal培养液含B27,脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF),全反式维甲酸(all—trans Retinoic Acid,ATRA),音猥因子(Sonic Hedgehog,SHH))诱导ECTO-MSCs向成骨细胞和神经细胞定向分化,并用组织化学染色、免疫荧光染色和蛋白免疫印记等方法,评价诱导ECTO-MSCs向成骨细胞和神经细胞定向分化的效果。
结果：①鼻中隔(包括两侧全层黏膜)冰冻切片经Nestin及CD44抗体免疫荧光染色显示,其阳性细胞广泛分布于鼻中隔两侧黏膜固有层内。阳性细胞为圆形或卵圆形,位于鼻中隔软骨与上皮之间,软骨细胞和上皮细胞染色阴性。②随着培养时间的延长,外胚层间充质干细胞增殖旺盛,在鼻黏膜细胞中比例不断增大。传代至第五代可获得大量较纯的外胚层间充质干细胞。免疫荧光和蛋白免疫印迹显示,纯化后的外胚层间充质干细胞表达Nestin,CD133,CD44,Vimentin,阳性率可达98％。③用成骨诱导剂诱导培养后,ECTO-MSCs碱性磷酸酶活性明显增强,在细胞表面形成大量的茜素红染色阳性的钙结节,细胞Collagen1表达水平明显升高；用神经诱导培养基诱导培养后,ECTO-MSCs的形态变化为神经细胞样形态,细胞高表达神经细胞标志蛋白NF-200,细胞发出细长突起并互相连接成神经网络。
结论：⑴ECTO-MSCs广泛分布于大鼠鼻中隔两侧黏膜固有层内,呈圆形或卵圆形,位于鼻中隔软骨与上皮之间。⑵可通过差速贴壁和连续传代培养方法,自鼻黏膜混合细胞中自然纯化并扩增出大量的。ECTO-MSCs。⑶纯化后传代培养的ECTO-MSCs纯度较高,细胞活力较强,并具有多向分化潜能,可作为种子细胞用于自体移植修复骨和神经组织损伤。