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糖苷化合物是一种分布广泛的天然产物,其中很多具有特殊的生物活性,是中药和天然药物发挥药效活性的物质基础,在疾病的治疗中具有重要的地位和药理学意义。通过酶法转化将已知天然糖苷转化成更具生物活性的化合物,是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。
本实验室从土壤中筛选到一株产糖苷酶菌株,镰孢霉菌ECU2042(Fusarium sp.ECU2042),它能够催化人参皂苷Rg3水解为抗癌活性更高的人参皂苷Rhz。
本文主要研究了镰孢霉菌ECU2042所产Rg3糖苷水解酶的纯化过程,寻找合适的纯化方法,最终获得了纯化酶,并考察了其理化性质,为此糖苷酶的进一步应用打好基础;对镰孢霉菌ECU2042糖苷酶催化人参皂苷Rg3水解体系进行优化,提高了酶的催化效能;探讨镰孢霉菌ECU2042糖苷酶在以价格相对低廉的人参总皂苷为起点制备人参皂苷Rh2及在其它有药用价值人参皂苷水解中的应用,最终不仅为糖苷酶库增加新酶源,而且为中草药等天然糖苷化合物的研究提供了有力的工具。
论文内容主要分为五个部分。
在第一部分中,考察了添加非离子表面活性剂对镰孢霉菌ECU2042糖苷酶催化人参皂苷Rg3水解反应的影响,其中PEGMME 350对酶反应促进作用最大。在对酶浓度、表面活性剂浓度、震荡频率和反应时间等反应条件进行优化以后,人参皂苷Rg3的转化率几乎达到100%,比没有添加表面活性剂的酶反应提高了25%。而且表面活性剂对酶的稳定性影响也很小,酶在添加表面活性剂的体系中半衰期为216h,仅比在未添加表面活性剂体系中少7h。
在第二部分中,通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、TSK凝胶层析和复性电泳这几种纯化手段的联合运用,从镰孢霉菌ECU2042中分离得到一个人参皂苷水解酶,该酶由TSK凝胶过滤和SDS变性凝胶电泳测得的分子量分别为78.7和39.1kDa,由二维电泳测得的等电点为4.4。在pH 5.0和50℃时酶具有最佳的反应活性,在pH4.0~6.5和不高于60℃时保持相对稳定,热失活能(Ed)为88.6kJ/mol。Ni+、Ca2+、Mg2+和Mn2+离子对酶反应都有一定的抑制作用,但是Cu2+和Fe3+等重金属离子对酶活没有明显的影响。该纯化酶对人参皂苷Rg3反应活性很高,但对对硝基苯基葡萄糖苷(pNPG)的活性非常低,且几乎不能水解纤维二糖。另外,该酶对其它一些烷基糖苷、芳香糖苷和天然糖苷也表现出不同程度的反应活性。该纯化酶对人参皂苷Rg3的米氏常数Km为2.37mM,最大反应速率Vmax为0.568μmol/(h·mg protein)。
在第三部分中,尝试用多种发酵法、双酶法和化学—酶法水解人参总皂苷制备人参皂苷Rh2,其中发酵法得到的水解产物中没有人参皂苷Rh2,双酶法虽有产物生成,但产率太低,化学—酶法在调整了体系pH后可将人参总皂苷中的Rh2含量提高到1%。用先酸解再酶解的制备方法在20ml体系中进行预制备,优化反应过程后得到了0.22mg/ml的产物。按照建立的制备方法,300ml体系得到62mg的人参皂苷Rh2纯品。
在第四部分中,考察了温度、pH及底物浓度对镰孢霉菌ECU2042粗酶催化人参皂苷Rb1水解反应的影响,得到了此水解反应的最优条件,并对该体系的反应进程进行了考察。最后用300mg粗酶,60mg人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷F2纯品16mg,转化率约为43.2%。通过部分纯化的方法考察了镰孢霉菌ECU2042中Rb1水解酶系的组成,发现此酶催化反应由多个同功酶共同完成,通过实验结果推断出镰孢霉菌ECU2042β-葡萄糖苷酶的Rb1水解途径为Rb1→Rd(G—ⅩⅦ)→F2。
在第五部分中,建立了以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂固定化镰孢霉菌β-葡萄糖苷酶的方法,通过考察固定化过程中的影响因素,包括pH、吸附时间、交联剂使用量、交联时间和加酶量,确定吸附—交联法固定化β-葡萄糖苷酶的程序为:壳聚糖8g,酶液100ml(0.20mg/ml,pH 6.0),再加入0.4%(w/v)的戊二醛,在25℃、100rpm震荡18h。固定化后酶活力为0.37U/mg,蛋白上载量为0.84mg/g载体,活性回收率为66.8%。用此法制备的固定化酶最优pH和温度与游离酶相同,但酸碱稳定性和热稳定性均比游离酶好,以0.5mg/ml的人参皂苷Rb1为底物水解10批后仍有78%的酶活,在4℃放置两个月没有明显的活力损失。