糖苷化合物是一种分布广泛的天然产物，其中很多具有特殊的生物活性，是中药和天然药物发挥药效活性的物质基础，在疾病的治疗中具有重要的地位和药理学意义。通过酶法转化将已知天然糖苷转化成更具生物活性的化合物，是被实践证明最行之有效的开发新药的途径之一。 本实验室从土壤中筛选到一株产糖苷酶菌株，镰孢霉菌ECU2042(Fusarium sp．ECU2042)，它能够催化人参皂苷Rg3水解为抗癌活性更高的人参皂苷Rhz。 本文主要研究了镰孢霉菌ECU2042所产Rg3糖苷水解酶的纯化过程，寻找合适的纯化方法，最终获得了纯化酶，并考察了其理化性质，为此糖苷酶的进一步应用打好基础；对镰孢霉菌ECU2042糖苷酶催化人参皂苷Rg3水解体系进行优化，提高了酶的催化效能；探讨镰孢霉菌ECU2042糖苷酶在以价格相对低廉的人参总皂苷为起点制备人参皂苷Rh2及在其它有药用价值人参皂苷水解中的应用，最终不仅为糖苷酶库增加新酶源，而且为中草药等天然糖苷化合物的研究提供了有力的工具。 论文内容主要分为五个部分。 在第一部分中，考察了添加非离子表面活性剂对镰孢霉菌ECU2042糖苷酶催化人参皂苷Rg3水解反应的影响，其中PEGMME 350对酶反应促进作用最大。在对酶浓度、表面活性剂浓度、震荡频率和反应时间等反应条件进行优化以后，人参皂苷Rg3的转化率几乎达到100％，比没有添加表面活性剂的酶反应提高了25％。而且表面活性剂对酶的稳定性影响也很小，酶在添加表面活性剂的体系中半衰期为216h，仅比在未添加表面活性剂体系中少7h。 在第二部分中，通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、TSK凝胶层析和复性电泳这几种纯化手段的联合运用，从镰孢霉菌ECU2042中分离得到一个人参皂苷水解酶，该酶由TSK凝胶过滤和SDS变性凝胶电泳测得的分子量分别为78.7和39.1kDa，由二维电泳测得的等电点为4.4。在pH 5.0和50℃时酶具有最佳的反应活性，在pH4.0～6.5和不高于60℃时保持相对稳定，热失活能(Ed)为88.6kJ/mol。Ni+、Ca2+、Mg2+和Mn2+离子对酶反应都有一定的抑制作用，但是Cu2+和Fe3+等重金属离子对酶活没有明显的影响。该纯化酶对人参皂苷Rg3反应活性很高，但对对硝基苯基葡萄糖苷(pNPG)的活性非常低，且几乎不能水解纤维二糖。另外，该酶对其它一些烷基糖苷、芳香糖苷和天然糖苷也表现出不同程度的反应活性。该纯化酶对人参皂苷Rg3的米氏常数Km为2.37mM，最大反应速率Vmax为0.568μmol/(h·mg protein)。 在第三部分中，尝试用多种发酵法、双酶法和化学—酶法水解人参总皂苷制备人参皂苷Rh2，其中发酵法得到的水解产物中没有人参皂苷Rh2，双酶法虽有产物生成，但产率太低，化学—酶法在调整了体系pH后可将人参总皂苷中的Rh2含量提高到1％。用先酸解再酶解的制备方法在20ml体系中进行预制备，优化反应过程后得到了0.22mg/ml的产物。按照建立的制备方法，300ml体系得到62mg的人参皂苷Rh2纯品。 在第四部分中，考察了温度、pH及底物浓度对镰孢霉菌ECU2042粗酶催化人参皂苷Rb1水解反应的影响，得到了此水解反应的最优条件，并对该体系的反应进程进行了考察。最后用300mg粗酶，60mg人参皂苷Rb1制备得到人参皂苷F2纯品16mg，转化率约为43.2％。通过部分纯化的方法考察了镰孢霉菌ECU2042中Rb1水解酶系的组成，发现此酶催化反应由多个同功酶共同完成，通过实验结果推断出镰孢霉菌ECU2042β-葡萄糖苷酶的Rb1水解途径为Rb1→Rd(G—ⅩⅦ)→F2。 在第五部分中，建立了以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂固定化镰孢霉菌β-葡萄糖苷酶的方法，通过考察固定化过程中的影响因素，包括pH、吸附时间、交联剂使用量、交联时间和加酶量，确定吸附—交联法固定化β-葡萄糖苷酶的程序为：壳聚糖8g，酶液100ml(0．20mg/ml，pH 6.0)，再加入0.4％(w/v)的戊二醛，在25℃、100rpm震荡18h。固定化后酶活力为0.37U/mg，蛋白上载量为0.84mg/g载体，活性回收率为66.8％。用此法制备的固定化酶最优pH和温度与游离酶相同，但酸碱稳定性和热稳定性均比游离酶好，以0.5mg/ml的人参皂苷Rb1为底物水解10批后仍有78％的酶活，在4℃放置两个月没有明显的活力损失。