目的：DNA甲基化被认为是反映细胞内DNA转录状态的重要表遗传学标记。本研究旨在对甲胎蛋白(AFP)启动子区域及CpG岛区域的甲基化状态与基因转录水平的相关性进行评估。 方法：1细胞培养：选取人源HepG2肝癌细胞系(株)、人源SMMC7721肝癌细胞系(株)及人成纤维细胞，分别进行传代培养，用于提取DNA及RNA。 2RNA提取及半定量RT-PCR方法分析AFP基因表达水平：引物设计软件设计RT-PCR引物。Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录生成cDNA。以cDNA为模板，扩增人AFP及β-actin基因片段，以β-actin为内参照，凝胶图像分析软件读取分析二维图像，对比AFP表达水平。3DNA提取及亚硫酸氢盐(HSO3-)处理：DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA，溶于TE后-20℃保存备用。酶切基因组DNA后进行HSO3-修饰，WizardDNAPurificationSystem纯化除去未反应的HSO3-，沉淀过夜获得MoDNA(ModificativeDNA)，-20℃冰箱保存备用。4设计引物：使用在线软件(http：//www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html)确定AFP基因CpG岛(GIs)，在线MethPrimer软件(http：//micro-gen.ouhsc.edu/cgi-bin/primer3_www.cgi)设计MSP、BSP引物。 5甲基化特异性PCR(MSP)方法检测AFP基因两区域在不同细胞中甲基化修饰密度：使用MSP引物(包括甲基化引物及非甲基化引物)扩增MoDNA模板，电泳对比MSP产物。 6Bisulfite测序PCR(BSP)方法确定AFP基因两区域在不同细胞中甲基化修饰位点：使用BSP引物扩增MoDNA模板，电泳核对产物长度后，回收纯化PCR产物，自动测序仪测序，对比甲基化修饰位点。 结果：1细胞形态学观察：肝癌细胞大小不等，排列紊乱，核浆比例倒置，失去正常的接触抑制，铺满瓶底后有重叠现象，具有无限增殖能力；正常人成纤维细胞呈梭形，细胞生长排列为漩涡状。 2RNA的提取：采取去除RNA酶污染的措施并使用DNA酶纯化处理RNA，以防止RNA发生降解或含有DNA杂带，选取符合以下条件样品：OD260/280＞1.8，甲醛变性胶电泳可见三条带：28s、18s、5s。 3RT-PCR结果：电泳可见HepG2细胞451bp处及350bp处各有一清晰的特异性条带；SMMC-7721细胞451bp处有一模糊的特异性条带，350bp处有一清晰的特异性条带；而对照人成纤维细胞只在350bp处有一清晰的特异性条带。片段长度与原设计长度一致。以β-actin作为内参照，凝胶图像分析软件读取分析二维图像显示，HepG2中AFP表达量约是SMMC-7721的10倍，用人成纤维细胞做对照获得阴性结果，表明实验结果可信具有特异性。 4细胞基因组DNA的提取：本实验要求DNA完整、纯度较高，能扩增出目的片段区域而不影响酶切及甲基化处理，以λ-HindⅢdigestDNAMarker作为参照，所提取DNA大小为23130bp。 5MSP法检测结果：在启动子区域，HepG2细胞非甲基化引物在150bp处可见清晰条带，而甲基化引物只见142bp处较弱的条带，表明其非甲基化程度较高；SMMC-7721细胞结果与之相反，表明其甲基化程度很高；而人成纤维细胞均为很弱的片段，表明其为部分甲基化。而在CGIs区域，分析知HepG2细胞甲基化程度高；SMMC-7721甲基化程度较之低；成纤维细胞非甲基化程度很高。 6BSP法检测结果：电泳显示以三种细胞MoDNA为模板进行扩增，均能扩增出目的条带，248bp处及139bp处各有一清晰的特异性条带，片段长度符合预期长度，测序结果使用Dssist2.0软件对比分析可知HepG2的非甲基化修饰位点发生率较高，SMMC-7721的甲基化程度较之高，而成纤维细胞甲基化程度整体很高。因此，此部分启动子检测区域，肝癌细胞甲基化程度高于成纤维细胞两个CG位点可作为肝癌检测位点，它们分别位于AFP全基因组序列649bp，825bp处。CGIs区域HepG2和SMMC-7721的甲基化程度均高于成纤维细胞，表明此区域可能与AFP基因是否表达存在相关性。 结论：1人AFP基因在肝癌细胞中表达，正常细胞中不表达；并且AFP基因表达水平在不同来源的肝癌细胞株中存在差异。 2AFP基因启动子区甲基化程度与AFP基因表达水平存在负相关，CGIs区域甲基化程度与AFP基因是否表达存在相关性。 3BSP法精确测定肝癌细胞甲基化程度高于成纤维细胞两个CG位点可作为肝癌检测位点，位于AFP全基因组序列649bp，825bp处。