第一部分：PcrV被动免疫在多重耐药铜绿假单胞致细胞毒性的保护作用研究目的：通过测定临床分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)Ⅲ型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)表达情况,比较耐药组和敏感组菌株T3SS表达有无差异,应用PcrV抗体,观察PcrV被动免疫对多重耐药铜绿假单胞菌致细胞毒性是否有保护作用。方法：随机分离保存临床分离的铜绿假单胞菌株,经过随机引物扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)分析确认为非同一克隆菌株,用微量肉汤稀释法测定菌株对临床常用抗假单胞菌抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)将菌株分为多重耐药组和敏感组。应用普通PCR和多重PCR扩增T3SS的pcrV基因和毒素基因(exoU, exoS,exoY, exoT),比较T3SS的基因型在耐药组和敏感组之间有无差异。Real-time PCR测定pcrV的相对表达水平,Western blot测定ExoU和ExoS的表达,从而比较T3SS的表型在耐药组和敏感组之间有无差异。应用BEAS-2B细胞株,铜绿假单胞菌感染后,测定培养基中的LDH浓度,比较应用PcrV抗体后,培养基中的LDH浓度有无变化,从而观察PcrV被动免疫对多重耐药铜绿假单胞菌致细胞毒性有无保护作用。结果：共分离出53株非同一克隆的临床菌株,包括25个多重耐药菌株和28株敏感菌株,pcrV, exoT, exoY几乎在所有菌株中均为阳性,exoU阳性率在30%左右,exoS阳性率在70%左右,两组之间无显著性差异；Real-time PCR比较之间pcrV相对表达无明显差异,Western blot比较两组之间ExoU,ExoS无显著性差异。铜绿假单胞菌感染后,培养基中LDH显著升高,应用PcrV抗体后,LDH浓度有显著下降,下降20%左右,统计学分析差异有显著性(P<0.05)。结论：铜绿假单胞菌的T3SS的表达相对稳定,在耐药组和敏感组之间无明显差异,PcrV被动免疫后,细菌的毒力下降,对多重耐药菌株致细胞毒性具有显著保护作用,在铜绿假单胞菌日益显著的耐药问题上,T3SS可以作为一个新的治疗靶点,有望解决日益严重的铜绿假单胞菌耐药问题。第二部分：PcrV被动及主动免疫在多重耐药铜绿假单胞菌致肺损伤的保护作用目的：选择一株多重耐药铜绿假单胞菌株,体外分泌ExoU蛋白,建立多重耐药铜绿假单胞菌感染的小鼠肺损伤模型,观察PcrV被动及主动免疫对小鼠的生存与肺损伤是否具有保护作用。方法：选择第一部分中的R4菌株建立小鼠肺损伤模型,通过气道内滴入法(5×10＾6cfu菌株)制作小鼠肺损伤模型。实验分组：被动免疫组,主动免疫组,抗生素治疗组,对照组。在感染后前12小时,每小时记录一次体温,以后每24小时记录一次体温,观察7天,观察小鼠的生存率。另外,分别在感染后的6小时和12小时处死小鼠,检测血液及肺组织细菌计数；检测肺泡灌洗液(BALF)中细胞的分类计数和蛋白浓度；检测湿干重比值(W/D)、髓过氧化物酶(MPO)活性；检测MIP-2、TNF-α、IL-6等细胞因子含量；观察肺组织病理。另外我们进一步检测分离出细菌的最低抑菌浓度(MIC)和生物膜表达情况,观察阻断PcrV后是否会影响细菌的MIC和生物膜的表达情况。结果：在R4感染后,对照组小鼠在7天内死亡率为100%,应用头孢他啶(500mg/kg q12h腹腔注射)后,小鼠的生存时间得到一定的延长,但也均于7天内死亡。应用PcrV抗体(与细菌预混后同时打入小鼠肺内),小鼠的生存率得到显著改善。另外PcrV被动免疫后,小鼠血中和肺内的细菌计数较其他两组有显著降低,肺部炎症显著减轻,W/D降低,肺泡灌洗液中蛋白浓度降低,肺泡灌洗液中中性粒细胞计数增加,且小鼠肺MPO活性在早期有显著增加,12小时后与其他两组相近。与此同时,PcrV被动免疫后,小鼠血清内MIP-2,IL-6,TNF-α水平降低,肺泡灌洗液中IL-6水平与其他两组相似,MIP-2降低,TNF-α早期升高,12小时后降低。PcrV主动免疫4周后,小鼠血清中PcrV抗体滴度在15-20μg/mL左右,此后感染R4,小鼠的生存率得到显著改善。另外,阻断PcrV后,细菌对头孢他啶的MIC没有变化,但是可以抑制细菌生物膜的表达。结论：PcrV被动免疫后,多重耐药铜绿假单胞菌感染小鼠的生存率得到显著改善,同时小鼠的肺损伤得到显著减轻。PcrV主动免疫四周后,小鼠体内血清抗体滴度达到高峰,多重耐药菌株感染后小鼠的生存率得到显著改善。PcrV被动及主动免疫在多重耐药铜绿假单胞菌株感染中发挥保护作用。并且阻断PcrV可以抑制细菌生物膜的形成,使细菌更易被清除。第三部分：角质细胞生长因子-2在铜绿假单胞菌致肺损伤的作用研究目的：探讨角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2, KGF-2)对铜绿假单胞菌致肺损伤的保护作用,及其对巨噬细胞吞噬功能的影响。方法：健康雄性Balb/c小鼠25g左右,分成3组,分组如下：1)无预处理组：无预处理,气道内滴入PBS60μl作为对照；2)对照组(control,C):气道内滴入铜绿假单胞菌(PAO1,1×10＾7cfu);3) KGF-2预处理组：动物在感染前72小时气道内滴入KGF-25mg/kg之后在制作感染模型。在PAO1感染后,前12小时,每小时记录一次体温,以后每24小时记录一次体温,观察7天,观察小鼠的生存率。另外,分别在感染后的6小时和12小时处死小鼠,取肺泡灌洗液,血浆,并留取肺组织。血液及肺组织细菌培养检测；分类计数肺泡灌洗液(BALF)中的细胞,检测BALF中的蛋白浓度。检测MIP-2、TNF-α、IL-6等细胞因子含量;观察肺组织病理。检测KGF-2预处理对肺组织p38MAPK/NF-κB信号通路活性的影响。体外培养小鼠巨噬细胞(RAW264.7)进一步探讨KGF-2对巨噬细胞吞噬功能的影响。结果：在PAO1感染后,对照组小鼠在7天内死亡率为90%左右,KGF-2预处理后,小鼠的生存率得到显著改善。另外KGF-2预处理后,小鼠血中和肺内的细菌计数较对照组有显著降低,肺部炎症显著减轻,W/D降低,BALF中蛋白浓度降低,肺泡灌洗液中中性粒细胞计数增加。于此同时,KGF-2预处理后,小鼠血清内MIP-2,IL-6, TNF-α水平降低,肺泡灌洗液中也有所下降。KGF-2预处理显著抑制了p38MAPK/NF-κB信号通路的活化。体外实验发现,KGF-2增强巨噬细胞吞噬功能。结论：KGF-2预处理能改善铜绿假单胞菌感染小鼠的生存率,同时减轻肺损伤程度,减轻炎症反应、水肿和出血。增强感染小鼠肺内和血中细菌清除率,其保护机制一方面可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路的活化有关,另一方面与增强巨噬细胞吞噬功能有关。