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水稻是我国和全世界重要的粮食作物,也是一个重要的功能基因研究的模式植物。各种非生物逆境(干早、冷害和高温等)对植物尤其是作物的生长和发育有着非常重要的影响,非生物逆境对作物的影响在许多地区已成为农业发展的瓶颈。因此进行水稻抗逆性研究,对提高作物对干旱、高温和低温等逆境的耐受能力具有重要意义。随着分子生物学和生物技术的发展,通过生物技术手段在分子水平对水稻进行遗传改良达到提高产量与抗逆性是一条十分有效的途径。
为了发现和分离新的水稻高活性启动子和耐逆基因,以便应用于生物技术遗传改良水稻的生产实际中与深入探讨植物耐逆的分子机理,本研究在Affymetrix水稻表达芯片分析超级杂交稻亲本培矮64S全基因组表达模式的基础上,从众多高水平表达基因和逆境诱导基因中筛选出了三个表达水平较高的基因OsSG1、OsSG4、OsSG5和一个逆境诱导基因OsMsr12(Oryza sativaL.multiplestress responsive gene12)进行基因启动子与耐逆基因的克隆与表达活性及功能研究。根据GenBank已知序列信息设计特异PCR引物,通过RT-PCR扩增,分别克隆到基因OsSG1、OsSG4、OsSG55’末端启动子区域的DNA片断,定名为Ospz1启动子、Ospz4启动子和Ospz5启动子。对获得的启动子进行序列分析,发现这些启动子中均有明显的TATA盒和CAAT盒,符合典型基因启动子的结构特征,同时还发现了若干可能参与基因表达调控的顺式作用元件。构建了由启动子引导的GUS重组基因,进行烟草和水稻的遗传转化。转基因烟草和水稻植株的GUS组织化学染色结果表明:只有启动子Ospz4在双子叶模式植物烟草中检测到表达,且表达部位局限于叶脉组织,而启动子Ospz1和Ospz5在烟草中没有检测到表达活性。Ospz1启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株的叶片、芽和根中高效表达,在其它器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。启动子Ospz4和Ospz5在转基因水稻的叶片、茎、根、花、芽以及胚乳中均检测到很高的活性。Ospz1、Ospz4和Ospz5启动子可用于农作物生物技术的遗传改良生产中。
基因芯片数据分析表明,OsMsr12基因受低温、高温、干旱诱导,在培矮64S的不同发育时期与组织器官中,表达水平均显著提高,平均上调幅度10.9倍,最高上调幅度达31.3倍,最低上调倍数也达到了2.3倍。根据GenBank已知相似基因序列设计特异PCR引物,通过RT-PCR扩增、获得了包含该基因完整ORF的长度为288bp的cDNA克隆。对该基因进行生物信息学分析,发现其序列中不含有内含子,编码一个含有81个氨基酸残基的小分子蛋白,没有发现已知的功能结构域。对其可能的启动子区域序列进行分析,发现多个与逆境反应相关的顺式作用元件。
为了研究基因OsMsr12在水稻耐逆反应中的作用功能,构建了遗传转化载体,转化水稻使之过量表达,对T1代9311转基因水稻幼苗进行抗高温、抗冷和抗干旱的测试实验。结果表明,在高温处理后,过量表达的转基因植株相对于对照水稻植株表现出明显的生长优势,存活率远高于对照植株。而在低温与干旱处理实验中,过量表达的转基因植株没有明显的生长优势。因此我们推测基因OsMsr12与水稻耐热性相关。
水稻高活性基因启动子Ospz1、Ospz4、Ospz5和耐高温基因OsMsr12可用于研究与遗传改良生产,具有重要的理论与实践价值。进一步的水稻启动子活性的定量测定与OsMsr12功能作用机理的研究正在进行中。