水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus,RDV）属呼肠孤病毒科（Reoviridae）,植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）成员,是引起水稻矮缩病的病原,由主要介体昆虫黑尾叶蝉以持久性增殖型方式传播。目前,RDV在介体叶蝉培养细胞内的复制循环周期已被系统地阐述,包括病毒侵入、复制、装配、扩散及释放等过程。病毒在叶蝉体内的侵染循回过程也有详细研究,但其在介体叶蝉体内的增殖机制知之甚少,尤其是病毒的复制和扩散机理还未曾报道。本研究针对RDV在其介体叶蝉体内的复制和扩散过程,以及传毒介体专化性的分子机理开展了进一步的探索。RDV病毒基因组由12条dsRNA组成,分别编码7个结构蛋白（P1,P2,P3,P5,P7,P8 和 P9）和 5 个非结构蛋白（Pns4,Pns6,Pns10,Pns11 和 Pns12）。主要外壳蛋白P8、和次要外壳蛋白P2、P9组成病毒粒体外壳;P1、P5和P7分别是依赖于RNA的RNA聚合酶、鸟苷酸转移酶、RNA结合蛋白,被包裹在核衣壳蛋白P3构成的内核中。在叶蝉培养细胞中,非结构蛋白Pns4可聚集成一种微丝;Pns10可形成装配成包裹病毒的小管,协助病毒扩散;Pns6、Pns11和Pns12则参与形成病毒原质（Viroplasm）的基质。Viroplasm是病毒复制和装配的工厂,本研究首先对Pns6、Pns11和Pns12在叶蝉培养细胞中的功能做了研究。将由体外合成靶向Pns6、Pns11和Pns12基因的dsRNA分别转染黑尾叶蝉叶蝉培养细胞,诱导的RNAi通过同时降低Pns6、Pns11和Pns12的基因相对表达量和病毒蛋白合成量,影响Viroplasm的功能和数量,从而显著减少病毒基因组RNA合成量,抑制子代病毒的合成,最终导致病毒侵染减少。这些证据说明dsRNA诱导的RNAi显著影响了病毒的复制周期,包括病毒蛋白的合成、病毒基因组dsRNA的合成和Viroplasm的形成,以及具有侵染力的子代病毒的生成。造成这些影响的原因与Pns6,Pns11和Pns12在Viroplasm中发挥的功能有关。推测Viroplasm基质蛋白Pns6、Pns11和Pns12与病毒的复制相关,缺少任何一个基质蛋白,都会导致病毒复制受阻碍。为了验证黑尾叶蝉培养细胞中观察到的结果,通过显微注射技术将dsRNA导入介体黑尾叶蝉。结果显示,注射dsRNA可降低对应基因的相对表达量,从而影响Viroplasm的功能,导致病毒积累水平降低,最终降低介体带毒率,并减缓病毒在介体内的扩散。上述研究明确了 Pns6、Pns11和Pns12三个蛋白在病毒侵染黑尾叶蝉过程中与病毒的复制相关,皆为RDV的复制关键因子,缺失任何一个因子,都将影响病毒的复制。先前的研究证明了非结构蛋白Pns12可独立形成类似Viroplasm的内含体,表明Pns12可能作为最基本的病毒蛋白参与了 Viroplasm的形成。为了解Viroplasm形成和成熟的机制,用酵母双杂交和GST pull-down两种互作体系验证Viroplasm蛋白的互作网络。结果证明Pns12可直接与Pns11和核衣壳蛋白P3互作,而且Pns11也可直接与Pns6互作。推测Pns12可能是Viroplasm基质的支架蛋白,作为Viroplasm形成和RNA复制的核心蛋白,调控了 Viroplasm形成、病毒蛋白招募,以及基因组复制,从而提出了一个Viroplasm形成和成熟的模型。持久性增殖型的RDV在完成复制后,子代病毒必须从初侵染的滤室上皮细胞扩散到其它组织进行扩大侵染,并最终侵染唾液腺,才能被介体叶蝉高效传播。因此RDV在介体叶蝉内的扩散也是病毒在介体内增殖的重要过程。先前的细胞学和遗传学的研究表明,由RDV非结构蛋白Pns10装配形成的包裹病毒粒体的管状结构在叶蝉培养细胞间负责病毒的扩散。本研究发现RDV可以利用包裹病毒的Pns10管状结构沿由肌动蛋白（actin）纤维束构成的黑尾叶蝉消化道的上皮细胞微绒毛移动,实现病毒的胞间扩散,并以穿过微绒毛的形式扩散到肠腔;在病毒跨过基底膜扩散到消化道外层肌肉细胞后,Pns10小管则沿着消化道表面的内脏肌肉细胞的actin肌肉纤维束移动,快速遍布整个消化系统、到达生殖系统和其它器官和组织,证实RDV可利用这类管状结构在介体叶蝉内扩散。进一步的研究发现,将体外合成靶向Pns10基因的dsRNA转染黑尾叶蝉培养细胞,可以诱导RNAi,使Pns10基因被干扰,导致Pns10装配成小管的能力受到显著抑制。利用中和抗体可结合游离病毒的特点,证明了抑制Pns10小管的形成会阻碍病毒对培养细胞的侵染,但对病毒的复制和积累无显著影响。将靶向Pns10基因的dsRNA膜饲喂介体黑尾叶蝉,发现Pns10基因被干扰,管状结构的形成受到抑制,以至于病毒在介体内的胞间扩散受到阻碍,介体传毒率显著下降,但病毒复制增殖未受到明显影响。这些结果证明Pns10蛋白形成的小管结构,可包裹病毒粒体协助病毒进行胞间扩散,是介体传毒关键因子;也证明了 RDV可利用自身非结构蛋白Pns10装配组成的包裹病毒的管状结构在由actin组成的细胞突出物上移动,实现自身在介体内的扩散,揭示了持久性增殖型的植物病毒在介体昆虫内扩散的一种新型机制。为了深入解析RDV利用Pns10小管在介体叶蝉内有效扩散的机制,利用酵母双杂交筛选Pns10的介体互作蛋白。结果有7个为Pns10的互作候选蛋白,分别是运脂蛋白前体、vigillin、细胞凋亡诱导因子、线粒体孔道蛋白、原肌球调节蛋白、卵黄原蛋白和细胞质actin。RT-qPCR实验显示,带毒黑尾叶蝉成虫的运脂蛋白前体、vigillin、细胞凋亡诱导因子和卵黄原蛋白基因相对表达量相对无毒叶蝉有下调,而线粒体孔道蛋白和原肌球调节蛋白基因相对表达量则上调。因为Pns10小管可与消化道上皮细胞微绒毛结合,而微绒毛的骨架是细胞质actin,因此选择细胞质actin进一步研究其与Pns10的互作。用验证膜蛋白互作的DUAL membrane system和GST Pull-down实验证明Pns10蛋白可与黑尾叶蝉细胞质actin特异性互作。Pns10蛋白与介体靶蛋白的互作模式可能导致了病毒在不同介体内扩散能力的差别,是介导RDV与传毒介体间存在亲和性识别差异的关键。因此,继续从扩散角度研究两种不同来源的黑尾叶蝉和电光叶蝉与RDV的关系。通过获毒和传毒能力的比较,认为来自病害暴发区的黑尾叶蝉是RDV的高效介体,而来自无病区的电光叶蝉是RDV的低效介体,并且Pns10小管因为不能顺利穿过电光叶蝉消化道微绒毛导致侵染受限,确认Pns10小管在不同介体消化道上皮细胞间的扩散能力差异调控了 RDV的传毒介体的专化性选择。病毒的体外注射导致了两种叶蝉都能以相近的水平传毒,而且Pns10小管可沿两种叶蝉消化道表面的肌肉纤维上移动,证明中肠的释放屏障阻碍了 RDV从电光叶蝉消化道扩散到外层肌肉层,揭示了该屏障在组织水平上,调控了 RDV传毒介体的专化性选择。分子水平上,Pns10蛋白可与黑尾叶蝉消化道微绒毛成分细胞质actin发生特异性互作,而与电光叶蝉的细胞质actin无互作。推测Pns10与细胞质actin的互作特异性在分子水平上影响了病毒在不同叶蝉体内的扩散能力,是RDV传毒介体专化性选择的内在机制。并且第262号的亮氨酸很可能在分子水平上决定了两种叶蝉胞质型actin与Pns10的互作与否,导致了 RDV在介体内的扩散差异,最终调控了 RDV传毒介体专化性。综上所述,本研究首次明确了 RDV的3个非结构蛋白Pns6、Pns11和Pns12是参与了病毒在介体叶蝉内的复制,是病毒复制的关键因子;证明了由Pns6、Pns11和Pns12,以及核衣壳蛋白P3参与了 Viroplasm形成和成熟的互作网络。首次阐明了 RDV可利用非结构蛋白Pns10装配成的可包裹病毒的管状结构在actin纤维束构成的细胞突出物上移动,实现病毒在介体消化道的胞间扩散,确认了 Pns10是负责病毒扩散的介体传毒关键因子。同时证明了由Pns10与介体叶蝉细胞质actin的互作,调控了 RDV传毒介体专化性。上述结果为建立基于阻断病毒在介体内有效增殖的调控策略提供理论基础。研究所应有的RNAi体系和介体昆虫细胞培养体系克服了由于缺乏反向遗传学技术,而无法在病毒侵染的情况下研究RDV蛋白功能的弊端,为研究介体传播持久性增殖型植物病毒的分子机理提供有效体系。