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研究背景胰腺导管腺癌(PDAC)是一种高致死率的肿瘤,5年生存率小于5%且预后不良,主要和诊断的时候已属晚期、早期以及进展性的侵袭和转移、缺乏有效的治疗手段相关。文献报道,大约50%的胰腺癌患者被确诊时已有远处转移。近年来,虽然胰腺癌的治疗手段发展迅速,但是死亡率仍然居高不下。虽然吉西他滨是胰腺癌的标准治疗方法,但是并不能明显延长患者的生存期,因此我们需要探索新的治疗方法和分子靶向药物以改善胰腺癌患者的预后。血管形成在很多肿瘤中已经通过VEGF信号通路抑制剂被证实是一个很有前景的治疗靶点。众所周知,胰腺癌是一个乏血供的肿瘤。前期的VEGF信号通路抑制剂如贝伐单抗、Axitinib、Sorafenib等在胰腺癌的II/III期的临床实验中虽有一定的疗效,但是结果不甚理想,目前零星的临床研究个案报道提示阿帕替尼对晚期胰腺癌患者具有良好的疗效。我们知道阿帕替尼是靶向血管生成的小分子TKI抑制剂,高度选择性抑制VEGFR2,和Sorafenib等TKI抑制剂相比主要竞争VEGFR2胞内的ATP结合位点,具有良好的抑制肿瘤血管形成和抗肿瘤活性。研究显示在很多人类肿瘤移植模型中单独给予阿帕替尼或者联合化疗药物,阿帕替尼具有良好的抗肿瘤活性,且耐受性良好、无明显毒性作用。此外,阿帕替尼也在多种肿瘤细胞如胃癌细胞、胆管癌细胞等中展开体外研究,结果显示阿帕替尼能明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移并能促进凋亡等。但是目前尚未见对胰腺癌的研究报道,基于上述所述,本课题主要以胰腺癌BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌细胞为研究对象,通过体内体外研究,探讨阿帕替尼对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响,并寻找可能的相关机制,为研究阿帕替尼的临床应用价值奠定基础。研究目的通过体内体外实验探讨阿帕替尼对胰腺癌恶性生物学行为的影响及其相关机制。研究方法1、体外培养人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌细胞,用不同药物浓度的阿帕替尼(20、40μmol/L)抑制VEGF-VEGFR2通路后,采用CCK8法检测细胞增殖能力,绘制生长曲线;通过流式细胞技术检测阿帕替尼对胰腺癌细胞生长周期分布的影响;采用流式细胞技术检测细胞凋亡变化;通过划痕和transwell肿瘤侵袭实验观察阿帕替尼对胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;通过ELISA检测自分泌的VEGF蛋白经VEGF通路抑制剂阿帕替尼处理后,表达量是否发生改变。2、体外培养人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌细胞,用不同药物浓度的阿帕替尼(20、40μmol/L)干预24小时后,通过Western-blot技术检测BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌细胞中VEGFR2/PI3K/AKT通路的磷酸化改变及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化。3、体外培养人BXPC-3胰腺癌细胞,将100ul细胞和PBS的混合液(含1×107细胞)接种于雄性、6周龄的BALB/C裸鼠的右腋下。当可触及肿块时(约0.5cm左右),随机分为对照组和阿帕替尼组,每组8只,通过灌胃给予阿帕替尼(200mg/kg/d)以及安慰剂。然后每三天测一次肿瘤的长和宽以及裸鼠的体重。给药3周后,处死裸鼠,取出肿瘤组织,进行称重。将取下的肿瘤组织免疫组化,检测两组组织中CD31、Ki67表达情况,另外通过Tunel法检测两组的凋亡情况。实验结果1、体外培养的人BXPC-3、ASPC-1、PANC-1胰腺癌细胞经不同浓度的阿帕替尼处理后,和对照组相比,三株细胞的生长明显被抑制。细胞周期结果显示在ASPC-1和PANC-1细胞中,低浓度的阿帕替尼引起S期和G2/M期的减少,使细胞增殖减慢,而高浓度的阿帕替尼主要引起G2/M期阻滞,从而抑制细胞增殖,在BXPC-3细胞中,低、高浓度的阿帕替尼主要引起G2/M期阻滞,细胞增殖被抑制。采用阿帕替尼体外干预24小时,阿帕替尼对BXPC-3和ASPC-1胰腺癌细胞具有促凋亡作用,但对PANC-1细胞没有明显影响。另外,阿帕替尼也可以抑制BXPC-3和ASPC-1细胞的侵袭和迁移能力,而在PANC-1中,实验组和对照组相比没有明显改变。由于阿帕替尼阻断VEGF/VEGFR2,使自分泌的VEGF的含量也明显减少,且阿帕替尼浓度越高,分泌量越少。2、Western-blot发现经阿帕替尼处理后,各组细胞的VEGFR2的磷酸化水平减少,同时下游通路PI3K/AKT的磷酸化也明显减少。VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信号转导通路可能参与阿帕替尼对胰腺癌生物学行为的影响。另外在BXPC-3细胞中抗凋亡蛋白BCL-2的表达量明显下调,且呈浓度依赖性,但在ASPC-1和PANC-1细胞未见明显改变。3、体内实验显示阿帕替尼能明显延缓胰腺癌移植瘤的生长。和对照组相比,阿帕替尼组的CD31的表达和Ki67阳性细胞的比例明显降低,说明阿帕替尼可以减少血管密度以及癌细胞的增殖。结论体内体外研究结果显示:阿帕替尼对胰腺癌具有抑制作用,能明显抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡,且具有浓度依赖性,可能和减少VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT通路的磷酸化以及减少VEGF的分泌有关。阿帕替尼在胰腺癌中可能具有一定的治疗前景,具体的临床效益值得进一步深入探索。