基于恒温微流控技术的肉源性成分快速鉴别研究

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“民以食为天,食以安为先”,食品安全重如泰山。肉制品作为蛋白质的主要来源,在食品中占有很大的生产和消费比重。而部分不法商贩为了谋求不正当利益,在肉制品加工过程中进行动物源性成分掺假,这种食品掺假行为不仅存在安全隐患,还极大地损害了消费者的利益,扰乱了市场秩序和健康发展,对民族宗教信仰造成潜在冲突,也对我国相关产品的进出口贸易形成了壁垒。因此,国家质检总局发布《关于加强进出口肉类及含肉制品检验检疫监管工作的警示通报》,要求对进口肉类及含肉制品是否掺假其它成分进行检测,食品中动物源性成分检测方法的建立和应用已经迫在眉睫,特别是适用于基层大规模筛查检测的快速检测技术。传统的检测方法操作繁琐,需要时间较长,多重PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR等依赖于升降温的昂贵仪器等都不利于现场实际检测和执法。环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal Amplification,LAMP)是在PCR的基础上创建的一种理想的手段,能很好的解决目前基因检测的弊端。本研究采用环介导等温扩增(LAMP)快速检测技术,分别根据黄牛、水牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠动物的线粒体基因序列设计特异性引物,特异性识别靶序列上的六个独立区域,对LAMP反应体系(引物浓度、Bst聚合酶添加量、反应温度)进行优化,并对引物的灵敏度、特异性和稳定性进行评价,成功建立六种动物源性成分的LAMP检测方法。将牛、羊恒温扩增的简便性及与微流控芯片的高通量特点结合,研发一种恒温微流控检测技术,进行特异性实验验证,5%、1%、0.5%、0.1%不同质量掺比的灵敏度实验以及实际样本的检测,进而实现对食品中动物源性成分的快速检测,实现对肉制品中动物源性掺假成分检测的快速化、高通量、自动化。研究结果如下:(1)本研究建立的动物源性LAMP检测体系分别对黄牛(Gen Bank No.MF925711.1)、水牛(Gen Bank No.MT182644.1)、山羊(Gen Bank No.LS992662.1)、绵羊(Gen Bank No.MT768241.1)、小鼠(Gen Bank No.KY018919.1)、大鼠(Gen Bank No.KP244683.1)进行展开,并对影响反应体系的引物浓度、Bst聚合酶添加量和反应温度进行优化,并根据出峰时间、峰高、重复性和扩增效率等指标来确认最终反应体系和反应条件。黄牛的最低检测限为0.1 fg/(?)L,并能够完成对0.1%的黄牛人工掺假样品的检测;水牛的最低检测限为1 fg/(?)L,水牛人工掺假样品的最低检出限为0.1%;绵羊在最佳反应条件下表现出良好的特异性,绵羊的最低检出限为1 fg/(?)L;山羊LAMP体系能将其阳性样本特异性检出,山羊的最低检测限为0.1 fg/(?)L,山羊和绵羊的LAMP检测方法均能检出对应源性成分含量为0.1%的人工掺假样品;小鼠和大鼠的最低检出限均为1 fg/(?)L,并可对其对应的动物源性成分含量为0.1%的人工掺假样品进行检测。本研究建立的牛、羊、鼠源性LAMP检测方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性良好、操作简单、性价比高等优点。补充和完善了动物源性检测的分子生物学检测方法,适用于基层检测单位或现场快速检测,实用性强,具有良好的研究价值、推广价值和应用前景。(2)本研究将环介导等温扩增方法与微流控芯片技术相结合建立水牛、山羊的恒温微流控检测方法,将样品提取核酸后加入芯片中,在仪器内进行恒温反应,反应30分钟后即可检出牛源性含量为0.1%的样品和羊源性含量为0.5%的样品,且具有良好的特异性,与国标PCR法相比恒温微流控芯片检测方法具有相同的检出率,能够满足实际样品检测的需要。恒温微流控检测技术的研发,可以实现一次检测多种动物源性成分,具有试剂消耗量降低、恒温扩增、反应时间短、对检测仪器要求低、自动化分析等优点,既可用于监管部门日常监督检测也可用于企业内部自检,控制产品的质量。本研究成果为保障人民生命安全,维护消费者利益,促进相关产业的健康发展,避免因食品问题引起民族矛盾及纠纷等都具有十分重大的意义。
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