膀胱肌组织能够产生不受神经系统控制的自发性动作电位(如离体膀胱组织在多种神经阻滞剂混合物作用下仍可发生自发收缩,在体膀胱可以发生不受抑制的兴奋收缩等)[1],这提示我们特定情况下,膀胱可能被某种“潜在起搏点”所调控。以往的观点认为这种自发性兴奋起搏来源于逼尿肌细胞,但更多的实验数据表明,逼尿肌细胞没有自发性兴奋的特点,无法担当膀胱起搏的任务[ 2]。所以,寻找和确认膀胱的起搏细胞成了亟待解决的问题。对胃肠道的研究发现,胃肠道肌肉的蠕动是由分布于其间的ICC细胞所发动的。胃肠道的ICC细胞成群分布,常常交织成网状,与神经末梢,平滑肌有很多的结构联系[3],它们已被认为是胃肠道蠕动的起搏细胞。近年来,形态与胃肠道起搏细胞相似的ICC细胞在膀胱被发现,它被认为有类似的起搏功能。目前对膀胱的ICC细胞所做的研究工作尚处于起步阶段,从取得的结果看,形态学研究较多,功能学研究较少,尤其对其是否是膀胱的起搏细胞阐释不清,对它在膀胱运动中的地位缺乏系统论证。本实验目的在于考察膀胱的ICC细胞在膀胱运动中是否起到起搏作用。分为三个环节予以证明:1. ICC细胞具有成为起搏细胞的结构基础,利用形态学方法研究ICC细胞的分布特点以及ICC细胞与逼尿肌细胞之间的结构关系; 2. ICC细胞具有成为起搏细胞的功能特征,利用对ICC细胞上起搏通道HCN和ICC细胞与逼尿肌细胞信号通讯的研究,说明ICC细胞具有产生起搏电流和将兴奋传递给逼尿肌的能力;3. ICC细胞的正常功能受到抑制后,膀胱逼尿肌功能下降。应用ICC细胞特异性阻断剂Glivec,分别在细胞、组织、在体三个水平研究逼尿肌的功能的改变。另外,在完成对ICC细胞在膀胱运动中的起搏作用进行论证后,我们进一步对不稳定膀胱中ICC细胞的结构和功能改变做了初步探索,研究逼尿肌不稳定与ICC细胞改变间的关系。主要的结果、结论如下:1.建立了能有效观察膀胱ICC样细胞的免疫组织化学实验方法:采用改良的国外学者制备膀胱铺片方法,通过c-KIT免疫组织化学染色技术,证实在膀胱的粘膜下层和逼尿肌肌束边缘存在有ICC细胞。2.发现了ICC细胞的结构分布特点:对ICC细胞的免疫荧光观察发现ICC细胞呈现明显的网络状分布,与胃肠道ICC网络相似。3. ICC细胞与逼尿肌细胞之间结构上存在密切联系:免疫荧光双标发现,ICC细胞与逼尿肌细胞相邻,且有相互交错分布现象。透射电镜发现,ICC细胞与逼尿肌细胞之间具有细胞间电信号传递的结构基础——缝隙连接。这样,ICC细胞具有了成为膀胱起搏的结构特征。4.发现了ICC细胞上有可产生起搏电流的HCN阳离子通道:采用c-Kit和HCN抗原的免疫荧光双标法,证明了c-Kit阳性的ICC细胞上具有HCN离子通道抗原的表达,这样ICC细胞上就具有可产生起搏电流的功能单位的存在。5. ICC细胞与逼尿肌细胞之间可以发生信号传递:荧光漂白实验发现,ICC细胞可将荧光染料有效传递给相邻的被漂白的逼尿肌细胞,这说明ICC细胞与逼尿肌细胞之间可以存在信号通讯。这也是ICC细胞可以将兴奋信号传递给逼尿肌细胞的功能基础。6.建立了特异性阻断ICC细胞功能的实验模式:利用对细胞游离钙的检测发现,c-Kit阻断剂Glivec主要影响ICC细胞的游离钙波动而对逼尿肌细胞没有明显影响,即Glivec作用靶点在ICC细胞上。这给我们提供了一个阻断实验的模式,即选择性阻断ICC功能,观察在ICC功能缺失的情况下,逼尿肌细胞功能的变化,从而考察ICC细胞在膀胱起搏中的作用。7.在细胞、组织、在体水平特异阻断ICC细胞后逼尿肌发生功能改变:细胞水平阻断使ICC细胞游离钙波动、ICC细胞与逼尿肌细胞之间的通讯受到明显抑制;而在组织和在体水平的实验均发现,肌收缩的振幅(收缩力)明显缩窄。这说明ICC细胞在膀胱起搏中发挥着重要的作用。8.不稳定膀胱中的ICC细胞网络结构和HCN阳离子通道的表达发生了明显改变:不稳定膀胱中的ICC细胞网络结构形态得到强化,而HCN阳离子通道的表达是明显增加的,这说明ICC的改变有可能是膀胱功能改变的原因。给我们提供了逼尿肌不稳定机制的一种全新解释方式。