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背景和目的:PICK1是近年发现的能调控AMPA受体转运的蛋白,具体调控机制尚不明确。PDZ结构域是公认的蛋白-蛋白相互作用组件,根据他们结合的PDZ结合域(PDZ配体)的不同可分为三种类型,而PICK1PDZ结构域既可以与Ⅰ型PDZ配体结合又可以与Ⅱ型PDZ配体相结合。它的这种特性主要是依赖于αB1上的赖氨酸(K83),K83使得PICK1既可以满足Ⅰ型PDZ配体与PDZ结构域形成氢键的需要,又可以满足Ⅱ型PDZ配体形成疏水键的需要。因此83位点是一个非常特殊的氨基酸位点。为了研究PICK1PDZ结构域与GluR2C末端相互作用中K83位点所起的作用,我们首先利用计算机对83位点进行剩余19个氨基酸的模拟点突变,接着对数据进行分析并结合PDZ结构域分类理论及氨基酸结构确定缬氨酸(V)、组氨酸(H)、丙氨酸(A)及谷氨酸(E)为重点研究对象,再经实验生物学去验证。这种生物信息学与实验生物学结合的方法也可以为今后解决蛋白间相互作用问题提供新的研究思路。
实验方法:1、质粒的构建:利用实验室已有GFP标记的野生型全长PICK1cDNA序列,设计突变引物,PCR扩增引入突变,然后用DpnI酶切去除没有突变的模板质粒,最后测序确认突变体构建成功。2、HEK293T细胞培养和转染:HEK293T细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养,每3天传代一次。细胞接种于60mm直径的培养皿或预先放置载玻片的12孔板,然后采用磷酸钙沉淀法转染HEK293T细胞。3、免疫细胞化学染色和荧光成像分析:长在玻片上的细胞固定后用0.2％TritonX-100透膜10分钟然后用特异性一抗和荧光二抗做全细胞染色,观察PICK1与GluR2共定位的改变。免疫细胞化学染色后的观察,共集簇数目等分析使用OLYMPUS激光共聚焦扫描显微镜。
结果:1.当野生型PICK1与GIuR2共转染时,HEK293T细胞有大量PICK1cluster,且这些PICK1cluster与GluR2共定位。当我们把构建的PICK1突变体单独与GluR2共转染时,不同的突变体表现出不一样的改变,将GFP-PICK1K83V和GFP-PICK1K83H分别与GluR2共转染,含有PICK1cluster的细胞与野生型转染相比没有显著差异;将GFP-PICK1K83A与GIuR2共转染,含有PICK1cluster的细胞有所减少;将GFP-PICK1K83E与GIuR2共转染,含有PICK1duster的细胞数目显著减少。
结论:PICK1PDZ结构域上的K83位点对于PICK1和AMPA受体GluR2的相互作用非常重要,改变该位点的氨基酸结构很可能会改变PICK1PDZ结构域与GluR2C末端结合所形成的疏水相互作用、氢键、静电相互作用,使得PDZ结构域与GluR2C末端的结合能力发生不同程度的改变。