龋病、牙髓病是人类常见的口腔疾病,发病率高,危害大。目前的治疗方法主要是彻底去除病变组织,严密消毒,利用银汞、复合树脂、牙胶等合成的牙科材料充填组织缺损处,达到修复病变组织的目的。然而,此类材料只能充填缺损,恢复一定的牙齿形貌,并不完全具备牙髓牙本质组织的生理功能,往往造成牙齿活性降低甚至丧失、变色、脆性增加;长此以往,患者的咀嚼与消化功能也会受到影响,甚至影响心理发展和社交活动。组织工程技术的出现为牙本质牙髓组织修复提供了新的契机,通过种子细胞、生长因子和支架材料的联合应用,有望再生具有功能的牙髓牙本质组织。支架材料在组织工程再生中起着关键的作用,不仅是种子细胞的载体,还是种子细胞的生存微环境,为目标组织的形成构建平台。对于再生仅通过狭小根尖孔与外界相通的牙髓牙本质复合体来说,支架材料的设计与选择显得尤为重要。理想的支架材料首先应该能够将细胞输送至不规则的、微小的组织缺损处,并且应当能够为细胞生长、黏附提供良好微环境,引导细胞分化形成新生组织。在前期研究中我们应用相分离技术构建出具有多孔结构和良好机械性能的纳米左旋聚乳酸(nf-plla)支架材料,已成功证实了其促进牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的作用。基于口腔临床的应用目标,可注射式材料更复合临床应用的需求,因此我们研发了星状聚乳酸高分子共聚物,并以此为原材料合成了可注射式纳米纤维多孔微球支架材料(nf-sms),在本研究中我们将人牙髓干细胞(hdpscs)接种于nf-sms支架材料上,检测nf-sms对hdpscs向成牙本质细胞分化的作用;并进一步尝试将nf-plla与nf-sms联合应用,复合hdpscs构建实验性牙髓牙本质复合体;此外,我们还为hdpscs三维培养自制了低氧装置,检测了低氧预处理对nf-sms上的hdpscs成血管能力的影响,在裸大鼠磨牙牙髓原位修复模型中获得了有一定形态和功能的牙本质牙髓样组织,为进一步摸索nf-sms在牙髓牙本质再生的临床应用潜能,提供了有意义的研究基础。所取得的研究成果如下:1.nf-sms促进hdpscs向成牙本质细胞分化和矿化的实验研究本实验通过测试hdpscs在nf-sms微环境中的黏附、增殖、分化,摸索应用nf-sms的恰当接种比例,检测hdpscs在nf-sms上向成牙本质细胞分化的能力。实验结果表明:hdpscs在nf-sms微环境中生长良好,较s-ms和nf-ms环境增殖快,矿化能力强,碱性磷酸酶(alp)活性、新生组织钙含量以及牙本质矿化相关基因表达明显上调,免疫缺陷鼠皮下注射结果显示了矿化组织形成,且牙本质涎磷蛋白(dspp)表达阳性,进一步证明了nf-sms促进hdpscs向成牙本质细胞分化的作用,提示nf-sms具有牙本质牙髓组织工程临床应用的前景。2.实验性人工牙髓牙本质复合体的研究本实验通过nf-plla支架材料接种细胞诱导矿化或者负载bmp-7缓释微球,尝试构建牙本质样组织,模拟牙髓再生的外周环境,进而诱导接种于nf-sms上的hdpscs分化形成牙髓,最终二者联合形成实验性牙髓牙本质复合体。实验结果表明:单独的牙本质样结构可以通过细胞接种nf-plla支架或者负载bmp-7缓释微球获得,hdpscs在nf-sms上复合后皮下注射获得血管生长丰富的组织,具有形成牙髓样结构的潜质,但二者机械结合并未获得具有生物活性的牙髓牙本质样结构,提示我们需要进一步探索构建牙髓样组织的微环境。3.低氧预处理与nf-sms联合应用于牙髓组织工程的实验研究本实验建立了一套细胞三维培养的低氧处理装置,通过比较不同结构的微球支架材料对低氧环境的敏感性,筛选促进hdpscs上调表达血管生长因子(vegf)的材料与表达VEGF的模式,通过检测自制低氧装置与市售低氧仓的细胞反应,确定低氧作用的效果;在筛选出的微球材料中进一步观察低氧诱导因子(HIF-1)和VEGF的表达关系与时间表达模式,筛选低氧预处理的条件,再通过皮下注射模型、皮下移植牙模型和裸大鼠原位牙髓再生模型进一步求证低氧预处理促进hDPSCs在NF-SMS微环境中形成牙髓样组织的可能性。实验结果显示:与纳米无孔微球、实体光滑微球相比,纳米多孔微球上接种的细胞对低氧敏感性高,hDPSCs在低氧环境下于NF-SMS上表达HIF-1和VEGF,时间早,增幅大,持续数日,NF-SMS是理想的低氧预处理细胞载体;皮下注射低氧预处理后的hDPSCs与NF-SMS混合物,可以看到低氧预处理组比常氧预处理组新生血管更丰富;皮下移植牙模型显示,牙髓腔内新生组织血管丰富,并且在牙本质内壁检测到DSPP表达;裸大鼠原位牙髓修复模型显示NF-SMS可以深入根管并降解,为新生组织让出了空间,新生组织血管丰富,在根管壁有DSPP表达。这些结果提示低氧预处理能够促进hDPSCs在NF-SMS微环境中分化新生牙髓样组织。