【摘 要】
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目的:探讨CRMP2对磷酸化的AMPA受体GluA2亚基转运的影响。方法:本次研究我们运用了分子克隆技术、GST-Pull down实验、Co-IP实验、免疫荧光成像和全细胞膜片钳等实验方法进行研究。首先,我们构建了GluA2 S880的磷酸化突变体和野生型GluA2亚基,并检测CRMP2与不同修饰状态GluA2亚基结合的差异;其次,在过表达CRMP2条件下,通过佛波酯(TPA)模拟外源性磷酸化及
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目的:探讨CRMP2对磷酸化的AMPA受体GluA2亚基转运的影响。方法:本次研究我们运用了分子克隆技术、GST-Pull down实验、Co-IP实验、免疫荧光成像和全细胞膜片钳等实验方法进行研究。首先,我们构建了GluA2 S880的磷酸化突变体和野生型GluA2亚基,并检测CRMP2与不同修饰状态GluA2亚基结合的差异;其次,在过表达CRMP2条件下,通过佛波酯(TPA)模拟外源性磷酸化及通过PKCζ模拟内源性磷酸化GluA2 S880,观察神经元AMPA受体GluA2亚基膜蛋白表达及突触后电位,分析其I-V曲线;最后,在过表达PKCζ的条件下,我们使用si CRMP2小分子干扰片段干扰CRMP2表达后,观察神经元m EPSCs并分析I-V曲线的斜率,研究CRMP2对磷酸化GluA2亚基转运的影响。结果:1)在佛波酯(TPA)外源性磷酸化GluA2的条件下,在海马神经元中过表达CRMP2可以促进磷酸化的GluA2的上膜,增强神经元m EPSCs的振幅和频率。2)通过GST-Pull down实验、Co-IP实验、亚细胞共定位实验发现CRMP2与GluA2存在相互作用,这种结合作用与GluA2的修饰状态有关。磷酸化的GluA2(S880D)与CRMP2结合增强,非磷酸化的GluA2(S880A)与CRMP2结合减弱。3)在HEK 293T细胞和培养的海马神经元细胞中,过表达CRMP2可以促进野生型GluA2的膜表达,并增强神经元m EPSCs的振幅和频率,同时增加I-V曲线的斜率。4)在通过PKCζ模拟内源性磷酸化GluA2的条件下,过表达CRMP2促进了神经元GluA2的膜表达丰度,并增强神经元m EPSCs的振幅,其频率未见明显差异,I-V曲线显示实验组斜率增加;在同样条件下,干扰CRMP2表达后,神经元的m EPSCs振幅和频率降低,I-V曲线的斜率减小。结论:1.CRMP2与GluA2存在蛋白互相作用,GluA2 S880位点磷酸化可增强与CRMP2的结合。2.CRMP2促进野生型GluA2的膜表达。3.CRMP2与磷酸化的GluA2(S880D)结合增强从而促进磷酸化的GluA2重新在膜上表达。
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