论文部分内容阅读
目的: 蛋白质的糖基化是一种重要的翻译后修饰,蛋白糖基化的改变是肿瘤的特征之一,糖链的改变影响糖蛋白的生物学功能,而且与肿瘤的发生发展和转移密切相关,异常糖基化的基础是糖基转移酶的异常。N-乙酰氨基半乳糖转移酶6(GALNT6)是催化O-糖基化起始的糖基转移酶家族成员之一,有研究显示其在乳腺癌中呈高表达状态,与乳腺癌的发生发展和转移有一定关系,但其具体作用机制尚不清楚。本课题为了研究GALNT6在乳腺癌进展中的机制作用,将靶向针对GALNT6的shRNA质粒转染进乳腺癌细胞MDA-MB-231中,观察GALNT6干扰后对乳腺癌细胞增殖、转移等生物学功能的影响,并深入探讨GALNT6对-乳腺癌发生发展中的作用与经典Wnt/β-catenin信号通路的相关性。此外在乳腺癌裸鼠模型中研究GALNT6在体内对乳腺癌转移的影响来进一步阐明GALNT6对乳腺癌转移机制的作用,这对GALNT6可能成为乳腺癌潜在的治疗靶点奠定基石出。 方法: (1)利用转染技术,通过脂质体把N-乙酰氨基半乳糖转移酶6的RNA干扰质粒Pgpu6/GFP/Neo-GALNT6和对照载体转入乳腺癌细胞MDA-MB-231中,经过抗性药物筛选(G418),构建GALNT6低表达的MDA-MB-231稳定细胞株。 (2)分别采用实时荧光定量PCR(SYBR Green法)检测GALNT6目的基因mRNA表达、Western Blot检测目的蛋白的表达,衡量GALNT6 shRNA干扰效果。采用实时荧光定量PCR、Western Blot检测细胞相关黏附因子E-cadherin、β-catenin的基因和蛋白水平表达,以及Wnt信号通路中下游因子cyclinD1、C-myc的蛋白表达情况。 (3)采用CCK8实验检测干扰GALNT6后乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖的变化;流式细胞仪检测细胞的凋亡;划痕和Transwell小室实验检测细胞迁移能力;Transwell基质胶实验检测细胞的侵袭能力。 (4)采用膜浆分离和核浆分离检测Wnt经典信号通路中关键核心因子β-catenin在细胞膜、浆、核中的蛋白分布情况,并用激光共聚焦技术进一步检测β-catenin在细胞中的定位情况。 (5)免疫共沉淀(Co-IP)实验检测GALNT6与MUC1、MUC1与β-catenin的关系。 (6)建立裸鼠乳腺癌模型:将100ul1×107/ml MDA-MB-231细胞悬液通过眼球后静脉丛注射于BALB/c-nu裸鼠体内。 (7) Bouins固定组织观察肺转移情况,HE染色观察肺部转移灶的情况。 结果: (1)实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western Blot对目的基因和蛋白的检测结果显示转入shRNA干扰组与未转染组、空载组相比,GALNT6的mRNA水平和蛋白水平表达均降低。 (2) CCK8实验结果显示GALNT6干扰组与空载组相比细胞增殖能力降低;流式细胞仪检测结果表明GALNT6低表组乳腺癌细胞凋亡增加;划痕和Transwell小室实验结果显示GALNT6低表组的迁移能力比空载组细胞降低;Transwell基质胶实验结果说明干扰了GALNT6之后,细胞侵袭能力降低。 (3)细胞黏附因子E-cadherin在GALNT6低表细胞中基因和蛋白水平比空载组都显著升高,β-catenin的总表达量降低,但是β-catenin在细胞膜分布增高、核分布降低。Wnt/β-catenin经典信号通路的下游靶因子cyclinD1、C-myc在GALNT6低表组中比空载组表达均降低。 (4) Co-IP实验显示在乳腺中GALNT6与MUCl-N、MUCl-C与β-catenin有相互作用。 (5)乳腺癌裸鼠模型肺转移情况显示,干扰GALNT6的表达之后,乳腺癌向肺部的转移明显减少。 结论: 本实验成功构建了GALNT6低表达乳腺癌MDA-MB-231细胞株;GALNT6低表达抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和转移,促进其凋亡。GALNT6低表达能够促进E-cadherin的表达,同时引起β-catenin在细胞内分布的变化,并导致Wnt/β-catenin下游靶基因的变化,说明GALNT6在乳腺癌中可能通过Wnt经典信号通路调节乳腺癌的发生发展和转移。裸鼠模型实验告诉我们GALNT6在体内促进乳腺癌向肺部的转移。综上所述,GALNT6在乳腺癌的转移过程中具有重要的作用,其作用机制可能是Wnt/β-catenin经典信号通路,GALNT6可能是潜在的乳腺癌治疗诊断的分子靶点。