以心血管疾病和肿瘤为首的重大疾病以患病率高、死亡率高、恶性程度高和并发症多等“三高一多”的特点严重威胁着我国人民群众的生命健康,影响着广大患者的生活质量。尽管临床数据表明早期诊断是提高治愈率和改善预后的关键,但这些重大疾病在发病前期普遍存在症状隐蔽,传统影像学表现不明显,体液中缺乏高特异性的诊断标志物等特点,使得常规的临床检验无法实现其精准早期诊断。组织学病理分析依然是临床确诊上述重大疾病的金标准,但目前常用的病理分析技术仍以抗体依赖的分子标志物标记技术为主,操作复杂,耗时较长,且对早期疾病的灵敏度和特异性较低,容易造成误诊和漏诊,错过了疾病治疗的最佳时期。因此,利用分析化学技术手段,发展上述重大疾病标志物的新型检测方法,实现其早期诊断,并针对性地采取有效的防治措施,对提升疾病治疗效果、避免病情恶化具有重要意义。在致病因子作用下,细胞内某些特殊功能分子异常表达造成的细胞原有结构或功能改变是疾病发生的起点。因此,对细胞内特定功能分子的表达水平检测和功能解析是探究疾病发生的分子基础,实现重大疾病早期诊断的根本方法。由于细胞膜对抗体的阻隔作用,目前传统的分子生物学方法主要采用将细胞破膜后再抗体结合的方式对胞内特定分子进行表达水平检测和功能分析,但这样必然会忽略细胞内环境因素对特定分子结构和功能的影响,不利于真实地反映出其在细胞内所参与的生命活动情况,同时此类方法对样本细胞数量有着较高的要求,无法完成单细胞水平检测,制约了其在精准分析领域的发展。对比抗体依赖的检测方法,基于荧光的生物探针凭借灵敏度高、检测速度快、无需破坏细胞膜等特点受到了科研工作者们的青睐。特别是近年来,随着纳米科技的发展,以金纳米颗粒为代表的纳米粒子凭借可自由进入细胞、结构可修饰性强和生物相容性好等优点被成功地用于制备各类纳米荧光生物探针,原位监测活细胞内乃至细胞器内特定分子在疾病发生过程中的表达变化,探究其表达异常在疾病发生发展中的作用,因此在疾病的标志物检测和早期诊疗领域有着广阔的应用前景。基于此,本文以心血管疾病和肿瘤类重大疾病发生早期的几种潜在标志物为目标分子,利用金纳米粒子、核酸适配体、肽链和荧光基团等元件开发了四种新型荧光生物探针,用于目标分子的高灵敏度、高特异性的检测分析,探究其在疾病发生早期发挥的作用,判断其是否可以作为上述重大疾病临床早期诊断的标志物,并利用探针为疾病的有效治疗提供了临床前研究数据支持,具体内容包括:1.基于LncRNA编码产生的微肽PLN在心力衰竭发生早期的标志物作用,我们开发了一种“aptamer nanoflares”结构的新型的纳米荧光探针首次用于心肌细胞内成像检测微肽PLN的表达情况。实验结果表明,除了具备良好的灵敏度、选择性、核酸酶稳定性和生物相容性以外,与目前常用的传统抗体类检测方法相比,该纳米探针能够原位可视化地成像检测不同状态下活心肌细胞内PLN表达的差异,以揭示PLN在心力衰竭发生过程中发挥的重要作用。该纳米探针还被成功地应用于心肌组织冰冻切片样品中PLN表达的快速成像检测,在临床心力衰竭早期诊断和病情评估方面有着不错的转化应用前景。此外,该探针的设计理念可拓展用于细胞内其他种类微肽的成像分析,成为以后研究此类特殊来源和功能微肽的新工具。2.基于线粒体Lon蛋白酶在缺氧诱导的心肌细胞凋亡早期的标志物作用,借助本课题组刚开发的Au-Se纳米平台,我们成功制备了一种新型Au-Se纳米荧光探针用于心肌细胞中高保真地实时原位成像检测Lon和Caspase-3的表达活化情况。利用此探针,我们验证了Lon和Caspase-3两种信号分子在缺氧诱导的凋亡信号通路中的上下游关系,并建立了通过对比探针产生荧光信号的强度来评估缺氧条件下心肌细胞状态的方法。此外,该探针还被用于证实ROS积累在缺氧诱导的细胞凋亡中的作用,并评价了ROS清除剂NAC对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制效果。该探针的应用为临床诊断中将Lon作为缺氧导致的早期心肌功能障碍的标志物及建立针对性的治疗方法提供了理论数据支撑。3.由于mRNA在机体生理功能中发挥了重要的作用,某些mRNA也被作为肿瘤等多种疾病的标志物。我们创新性地提出了一种新的Au-Se键合成方法,并以此构建了一种名为Au-Se NFs的新型Au-Se-DNA纳米探针,将nanoflares中的Au-S键升级成更加稳定地Au-Se键。对比普通的Au-S nanoflares,升级改造后的Au-Se NFs在检测过程中对高浓度硫醇类物质的干扰表现出了优异的抵抗能力,使其在细胞内能够产生更真实的荧光响应信号,因此被成功的应用于精准荧光成像检测多种乳腺癌细胞中vimentin mRNA表达。伴随着核酸适配体的开发与应用,DNA链的特异性靶向结合原理已不再局限于简单的链间互补配对,因此该探针合成方法可被进一步拓展应用于多种Au-Se-DNA类纳米传感器的制备,实现细胞内各种RNA、DNA乃至蛋白类物质的高保真检测分析,在基础研究和临床检验工作中有着广阔的应用前景。4.基于血液中外泌体PD-L1在肿瘤免疫逃逸和PD-1/PD-L1免疫治疗效果预测中的重要标志物作用,我们开发了一种简单、快速、低成本的TARACET-PCR方法用于高选择性、高灵敏度地定量分析通过PD-1/PD-L1已与T细胞结合的外泌体表面的PD-L1浓度。该方法独特的双适配体探针特异性识别结合激活机制可有效的避免样品中可溶性PD-L1对检测结果的干扰,在无需超高速梯度离心操作的情况下直接检测T细胞外泌体复合物上的外泌体PD-L1浓度,因此能够更直接地反映外泌体PD-L1介导的T细胞耗竭程度。未来在大样本临床统计数据的支持下,该方法不仅有望作为肿瘤诊断的重要指标,还可以进一步发展用于临床肿瘤免疫疗法用药指导和治疗效果预测,有着重要的临床应用价值。