乙酰胆碱酯酶(acetylcholineste7ase，AChE，EC3.1.1.7.)是昆虫神经传导中的一种关键酶，在胆碱能神经突触间，通过催化神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ATCh)来维持神经冲动的正常传递。AChE是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。由于杀虫剂的大规模长期的使用，不仅带来巨大的环境污染，而且导致许多种昆虫对杀虫剂产生了抗性。家蚕是农业生态系统中对农药十分敏感的重要经济昆虫，也是我国农药登记中所列环境生态的非靶标生物之一。农、林害虫中约有70％的种属于鳞翅目，而家蚕作为鳞翅目昆虫的代表已有长久历史，所以研究家蚕的乙酰胆碱酯酶基因，可为开发对害虫高效而对环境没有污染的新型药剂提供科学依据，不仅可以缩短药剂研发周期，大幅降低研发成本，还可望开拓农林害虫新的防治途径。本研究以家蚕乙酰胆碱酯酶作为研究对象，初步研究了家蚕乙酰胆碱酯酶的生化特性，并设计了特异性的引物，首次扩增得到家蚕两种类型的ace基因，为家蚕中存在两个ace的编码坐位提供了证据，与家蚕基因组数据库进行比对后发现了家蚕aces的基因结构；同时将两个基因分别转入大肠杆菌和昆虫细胞进行了表达研究，制备了多克隆抗体，初步研究了在细胞中表达的家蚕乙酰胆碱酯酶的功能。同时我们表达并回收了家蝇的乙酰胆碱酯酶。主要研究结果如下： 1、对家蚕乙酰胆碱酯酶(AChE)的生化特性进行了研究，结果表明，家蚕AChE水解乙酰胆碱(ATCh)的效率明显高于丙酰胆碱(PTCh)和丁酰胆碱(BTCh)。在pH8.0和37℃下，酶的活力最高，对氧磷和毒扁豆碱对家蚕AChE酶的抑制中浓度I50分别为9.8×10-7M和4.8×10-7M，同时与蜜蜂和家蝇等昆虫比较的结果，表明家蚕的乙酰胆碱酯酶的活性只维持在较低的水平，这可能也是家蚕对有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂很敏感的一个原因。 2、首次克隆到编码家蚕乙酰胆碱酯酶的两个基因，分别命名为Bmacel和Bmace2，为家蚕乙酰胆碱酯酶的双基因编码提供了直接的证据。1型家蚕乙酰胆碱酯酶基因全长3851bp，被2个内含子隔开。2型家蚕ace基因全长大约27kb，基因内含有5个内含子。Bmacel基因编码区全长为2052bp，预计编码683个氨基酸残基，SignalP预测到一个17氨基酸残基的信号肽。Bmace2编码区长度为1917bp，编码一个638个残基的蛋白，预测有一个23个氨基酸残基的信号肽。同时将两个基因与电鳐，果蝇等其它昆虫序列联配的结果表明，该基因具有乙酰胆碱酯酶基因的特性：保守的催化三联体，6个半胱氨酸残基形成三对二硫键，保守的氧阴离子洞，保守的FGESAG基序。 3、利用大肠杆菌表达系统，大量表达了融合蛋白GST-AChEl和GST-AChE2，并采用传统的割胶回收的方法，回收了两种蛋白，将两种表达产物免疫家兔，制备了兔抗多克隆抗体。酶联免疫吸附试验表明，两种抗体的效价均为1：6.4×104。 4、将克隆好的两个基因分别在Bac-to-Bac系统中进行了表达，同时为了提高表达产物的产量，分别构建了去除蛋白C端疏水肽的载体，并分别进行了表达。结果表明，家蚕乙酰胆碱酯酶基因在该系统中得到了正确的表达，但是仅表现出相对较低的活性，糖染色分析证实家蚕乙酰胆碱酯酶是一种糖蛋白。与其它几种昆虫乙酰胆碱酯酶的活性比较也发现家蚕的乙酰胆碱酯酶活性比较低，抑制实验表明，表达产物对毒扁豆碱和对氧磷更为敏感。2型乙酰胆碱酯酶的Ⅰ50比1型的偏低。 5、克隆了家蝇敏感品系的乙酰胆碱酯酶基因，并分别将该基因转入原核和真核表达载体进行了表达，在大肠杆菌里的表达产物为无活性的包涵体，蛋白复性后也仅表现出很低的活性。真核表达产物具有良好的生物学活性，我们大量表达了该蛋白,并利用盐酸普鲁卡因胺亲和层析的方法，纯化了该蛋白，蛋白纯化倍数为41倍，蛋白回收率为17.94％。细胞里表达的粗酶液和纯化后的产物对对氧磷和毒扁豆碱的抑制实验表明纯化后的乙酰胆碱酯酶对两种抑制剂敏感性都有所下降。 6、利用Paupver4.0软件包，采用邻接法进行了乙酰胆碱酯酶的进化分析。昆虫的ace进化主要分为两大分支，第Ⅰ分支包括同翅目、双翅目、鳞翅目、蜚蠊目的很多昆虫和膜翅目的蜜蜂；第Ⅱ分支除包括第Ⅰ分支的所有昆虫外，还包括双翅目的蝇类，和另外几种昆虫。本文克隆得到的家蚕两种类型的乙酰胆碱酯酶基因也分别归属于这两大分支。