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目的: 肿瘤转移是临床上较为常见的,也是乳腺癌治疗过程中的一大难点,其中关于肿瘤转移的机制仍需要进一步研究。本研究的目的是探讨circRNAs(Circular RNA,环状RNA)的表达水平与乳腺癌细胞的迁移、侵袭及预后的关系,为未来的靶向治疗提供有效的证据。 方法: 1、采用circRNAs微阵列分析筛选出转移相关的circRNAs,并用RT-qPCR(Real-time quantitative polymerase chainreaction,实时荧光定量聚合酶链式反应)进行验证。 2、构建合成了circular RNA THBS1的过表达质粒和siRNA,分别转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞中,应用划痕和transwell方法检测circular RNA THBS1对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。 3、预测分析circRNA-miRNA调控网络,通过miRanda和RNAhybird等生物信息学软件预测与circular RNA THBS1相结合的miRNA,并用双荧光素酶报告系统进行验证是否与miR-129-5p结合。 4、进一步探究miR-129-5p的功能,分别将miR-129-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)转染至细胞中,应用划痕和transwell方法检测miR-129-5p对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。 5、采用生物信息学软件如Targetscan等预测miR-129-5p的下游潜在靶基因,然后分别转染miR-129-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)干预细胞,应用RT-qPCR法检测细胞中SOX4(SRY-box4)mRNA(messenger RNA,信使RNA)的表达。同时使用双荧光素酶报告系统进行验证miR-129-5p与下游靶基因SOX4结合的关系。 6、利用TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌症数据库)数据库绘制Kaplan Meier生存曲线,验证miR-129-5p及SOX4的表达水平与患者生存时间之间的相关性。 结果: 1、芯片分析挑选出与转移相关的circTHBS1,进一步使用RT-qPCR验证发现circTHBS1在MDA-MB-231细胞系中的表达水平比在MCF-7细胞系中明显上调。应用FISH(fluorescence in situ hybridization,荧光原位杂交)实验可以发现circTHBS1主要定位在细胞质中,发挥调节miRNA的作用。 2、分别转染circTHBS1过表达模拟物和si-circTHBS1到MCF-7和MDA-MB-231细胞中,PCR检测表达水平及转染效果,结果显示转染circTHBS1过表达质粒的MCF-7细胞的迁移侵袭能力明显升高;转染si-circTHBS1后明显减弱了MDA-MB-231细胞的迁移侵袭能力。由此可推测circTHBS1可以促进乳腺癌细胞的迁移侵袭。 3、生物学信息软件(如miRanda,RNAhybrid等)预测分析出miR-129-5p是circTHBS1结合的靶向miRNA,同时TCGA数据库分析发现miR-129-5p在乳腺癌中的表达与癌旁组织相比较明显下调,Kaplan Meier生存曲线结果也表明miR-129-5p低表达的患者预后较差。双荧光素酶报告基因结果表明,共转染野生型(WT)/miR-129-5p mimic这组细胞的荧光比值相比较于转染突变型(MUT)/miR-129-5p mimic及NC组是显著降低的,且具有统计学意义。同时使用RT-qPCR检测miR-1295p的表达水平,结果也显示了miR-1295p的表达水平和circTHBS1的表达水平呈负相关。由此可以推断,circTHBS1可以吸附调节miR-129-5p的表达。 4、将miR-129-5p模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)转染进MDA-MB-231和MCF-7细胞中,相比对照组,转染了miR-129-5p模拟物(mimics)后MDA-MB-231细胞中的miR-129-5p表达水平明显上高,且减弱了MDA-MB-231细胞的迁移侵袭能力;转染miR-129-5p抑制剂(inhibitors)后MCF-7细胞中的miR-129-5p表达水平比对照组降低,且明显增强MCF-7细胞的迁移侵袭能力。 结果表明,miR-129-5p抑制了乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。 5、利用生物信息学软件预测与miR-129-5p相结合的靶基因,我们发现SOX4是miR-129-5p的下游靶基因。RT-qPCR发现miR-1295p与靶基因SOX4的表达呈负相关。同时双荧光素酶报告基因结果表明,共转染SOX4-3’-UTR野生型/miR-129-5p mimic组细胞中的荧光比值相比转染突变型/miR-129-5p mimic及NC组细胞中显著降低。因此,认为SOX4是miR-129-5p下游调控的靶基因。 结论: 1、circTHBS1可以促进乳腺癌细胞的迁移侵袭。 2、circRNA-miRNA调控网络预测分析miR-129-5p是circTHBS1的相结合的靶向miRNA,其表达受circTHBS1的负向调控。 3、生物信息学软件显示SOX4是miR-129-5p的下游靶靶基因,其表达受miR-129-5p的负向调控。 4、circTHBS1可能通过吸附结合miR-129-5p来调控靶基因SOX4在细胞中的表达,从而影响乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。 5、抑制circTHBS1的表达很有可能改善乳腺癌病人的预后。