大白菜是完全花异花授粉作物,具有明显的杂种优势。在配制杂交种的过程中,雄性不育材料的利用是一种较好的杂交制种途径。大白菜雄性不育遗传机理和分子机制研究一直是人们关注的热点。在前期研究中,本课题组发现了一份大白菜复等位基因遗传的雄性不育材料,并用其配制出了具有100%不育株率的核基因雄性不育系。利用该不育材料构建分离群体,对不育基因进行了定位,将其定位在A07染色体6700-6800kb之间。为了克隆不育基因,本研究利用该不育系统的纯合不育株(MsMs)构建BAC文库,通过筛选定位区间内的BAC克隆,进行测序比对,寻找差异基因；通过对雄性不育“两用系”可育株(MsfMs)与不育株(MsMs)花蕾进行转录组测序,找出差异表达基因并分析它们的功能和参与的代谢途径；鉴定花蕾中表达的miRNAs,并对其进行了靶基因预测,探寻miRNA在雄蕊育性调控中的作用。上述研究结果可以为筛选鉴定大白菜核不育复等位基因(Ms、Msf和ms)奠定基础,并为核雄性不育相关基因和miRNAs的研究提供了数据库,有助于揭示大白菜雄性不育的分子机制。主要研究结果如下：1.通过对大白菜雄性不育“两用系”的不育株与可育株花蕾形态观察,发现不育株除雄蕊不产生花粉外,其他花器官发育正常。利用石蜡切片对不育株与可育株花药细胞结构进行观察,发现花药发育前期两者没有明显差异,后期不育株花粉母细胞不能进行正常的减数分裂,绒毡层细胞异常膨胀,导致不育株花药的花粉囊皱缩。2.根据前期对大白菜雄性不育基因Ms及其恢复基因Msf的定位结果,设计筛库引物,在利用雄性不育“两用系”不育株叶片构建的BAC文库中筛选到2个对应定位区间内的BAC克隆,即FH20-SRF1和FH48-LCSK5。利用第3代测序技术,对这2个BAC克隆进行测序,FH20-SKRF1插入基因的长度为127658bp, FH48-LCSK5为130005bp。两个BAC克隆可以拼接,拼接后长度为233305bp,重叠区域有24358bp。在拼接后的序列中能找到筛库引物SKRF1和LCSK5,并且定位标记LZY6位于拼接序列68462-68849bp的区域,说明这2个BAC克隆能够完全覆盖A07染色体6700-6800kb区间。将拼接序列与Brassica Database中的大白菜基因组序列进行比对,发现部分区域发生了倒位,并有大片段插入。对拼接序列进行基因预测,共预测到57个基因。在MsfMsf基因型材料中将这57个基因进行克隆测序,发现有7个基因的序列与MsMs基因型材料的BAC克隆存在差异,且这7个基因全部位于插入片段区域。3.利用RNA-seq技术,对大白菜雄性不育“两用系”可育株与不育株的花蕾进行测序分析,按照无参考基因组进行unigene组装,分别得到了70703和70799个unigene。将BAC克隆测序比对得到的7个存在序列差异的基因,与unigene进行比对,有5个能够比对上,说明这5个基因真实存在并且能够正常表达。4.对大白菜雄性不育“两用系”可育株与不育株花蕾中的基因表达水平进行分析,发现有1013个差异表达基因,包括与花粉发育相关的AMS、MS2、VGD1以及果胶酶类基因等等。在这些差异表达基因中,有475个在可育花蕾中特异性表达,6个在不育花蕾中特异性表达。这些特异性表达基因中有82个基因编码未知功能蛋白,其中大部分在花粉和花粉萌发阶段表达。对差异表达基因进行GO富集分析,显著富集的GO terms有19个。对所有的差异表达基因进行pathway富集分析,共富集到5条pathway,分别是：①戊糖和葡萄糖醛酸转换途径、②丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢途径、③半胱氨酸和蛋氨酸代谢途径、④维生素C代谢途径、⑤淀粉蔗糖代谢途径。利用qRT-PCR对其中的30个差异表达基因在“两用系”可育株与不育株花蕾中的表达量进行分析,其结果与测序结果一致,验证了测序结果的准确性。5.以大白菜雄性不育“两用系”可育株与不育株花蕾为试材,分别构建small RNA测序文库,进行高通量测序,在两文库中分别获得了132和144个已知的miRNA,并预测到22和24个新的miRNA。对35个已知的miRNA家族进行了靶基因预测,并对靶基因进行了功能注释。筛选出19个miRNA在不育株与可育株花蕾中差异表达。在这19个差异表达的miRNA中,大部分在不育花蕾中表达量高,只有5个在可育花蕾中表达量高。这些差异表达的miRNA的靶基因,部分与花、雄蕊、花粉的发育相关,例如AP2、果胶甲酯酶抑制剂家族蛋白等。有5个miRNA的靶基因在转录组测序中也为差异表达基因,说明其可能受miRNA调控。对所有差异表达的miRNA进行qRT-PCR验证,其结果与测序结果大体相同,验证了测序结果的可靠性。