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真菌感染尤其是深部真菌感染的频率和严重性急剧的增加,寻找治疗深部真菌感染的药物十分迫切。细胞壁是低等真核生物所特有而哺乳动物中不存在的细胞组分,对真菌的存活至关重要。β-1,3-葡聚糖(β-1,3-glucan)是细胞壁中含量最多并且最重要的成分,无论它们在数量或质量上发生变化都会对真菌细胞产生致命的影响。β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucansynthase)存在于细胞膜中,催化β-1,3-葡聚糖的合成,是真菌细胞壁合成的最重要的酶之一。抑制β-1,3-葡聚糖合成酶,将抑制真菌的生长繁殖。因此葡聚糖合成酶是理想的抗真菌药物的作用靶点,以此为靶点的药物可以避免细胞毒性,并且与多烯类和唑类等抗真菌药物不产生交叉耐药。
本研究从白色念珠菌ATCC10231培养液中提取了葡聚糖合成酶蛋白,确立了葡聚糖合成酶活性的测定方法,初步建立了以β-1,3-葡聚糖合成酶为靶点的抗真菌药物筛选模型,并且用此模型对本所的3200个微生物发酵液样品进行了筛选,从细胞水平筛选可以抑制白色念珠菌的微生物发酵液样品,得到抑制率大于80%的阳性样品112个,筛选阳性率为3.5%。运用所建立的β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂筛选模型对那112个发酵液样品进行筛选,得到抑制率大于80%的阳性微生物发酵液样品6个,筛选阳性率为5.3%。
β-1,3-葡萄糖聚合体是白色念珠菌细胞壁中最重要的组成部分,在维持细胞的机械强度和正常的渗透压上起着非常重要的作用。β-1,3-葡聚糖合成酶是葡聚糖合成途径中的关键酶,催化UDP-葡萄糖聚合成β-1,3-葡聚糖。研究表明:β-1,3-葡聚糖合成酶是由催化亚基和调节亚基两个亚基组成。催化亚基是大的膜整合蛋白分子,具有16次跨膜结构,小的GTP结合蛋白CaRho是葡聚糖合成酶的调节亚基。二者共同决定着酶的生物学功能。任何一个亚基单独存在时都没有催化活性,只有把两种成分聚合时才可以发挥葡聚糖合成酶的活性。本研究应用分子生物学的方法,克隆表达β-1,3-葡萄糖合成酶的调节亚基,为建立以调节亚基为靶点的抗真菌药物筛选模型奠定基础。
我们以白色念珠菌ATCC10231提取的DNA为模板,应用PCR方法得到CaRho基因编码的DNA片断,克隆至pGEM-T载体,构建了pT-CaRho,对pT-CaRho测序结果表明PCR产物的DNA序列与文献报道的完全相同。再将此片段克隆至巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达载体PPIC9k中,构建重组表达质粒PPIC9K-CaRho。SalI线性化重组表达质粒,电转化线性的PPIC9K-CaRho片段至毕赤酵母宿主菌GS115中。重组菌株以1%终浓度甲醇诱导表达,SDS-PAGE对表达产物的分析表明:表达产物出现了分子量为20kD的蛋白条带,实现了β-1,3-葡聚糖合成酶调节亚基的高效表达,为建立以CaRho蛋白为靶点的抗真菌药物筛选模型奠定了坚实的基础。