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基因组编辑技术是通过精确改变特定基因来研究其功能,是现代生物学研究的重要手段。近年来兴起的基因组编辑技术主要有ZFN技术、TALEN技术和CRISPR/Cas9技术,其中CRISPR/Cas9技术凭借其操作简单、打靶高效等优势迅速成为新一代基因组编辑技术。已经报道的关于Fam49b基因的研究极少,本实验室前期的研究表明,Fam49b可能是通过影响神经嵴细胞的增殖或/和凋亡来参与爪蟾胚胎神经嵴的发育。本研究的目的是运用CRISPR/Cas9技术构建Fam49b基因敲除人类细胞系,并对该细胞系的生物学特性进行初步研究。本研究的主要研究方法和结果如下：1、通过RT-PCR和Western blot实验确认Fam49b在三种人类细胞系HEK293T、U251和U87中的表达,并通过免疫荧光实验发现Fam49b蛋白在细胞质和细胞核中广泛表达。2、设计靶向人类Fam49b基因的两个靶位点T1和T2,成功构建其CRISPR/Cas9系统打靶载体,并检测其在293T细胞中的打靶效率,分别约为45%和32%。3、利用有限稀释法成功建立21个HEK293T单克隆细胞株,利用PCR-RFLP方法和Western blot实验筛选出Fam49b1异构体敲除的单克隆细胞株——7号细胞株,并鉴定该细胞株的等位基因序列。4、通过对7号细胞株Fam49b基因的转录本和蛋白的进一步研究,发现人类细胞Fam49b基因的新异构体Fam49b2,并结合生物信息学信息解释人类Fam49b基因的选择性剪接方式。5、利用流式细胞术和CCK-8实验研究Fam49b1的缺失对HEK293T细胞的生物学特性的影响,发现Fam49b1的缺失可能抑制细胞的增殖能力。6、在U251细胞系中应用CRISPR/Cas9技术,运用流式细胞分选术成功获得Fam49b基因高突变率的U251细胞系。本研究第一次运用CRISPR/Cas9技术在人类细胞中对Fam49b基因进行特异性敲除,建立Fam49b1蛋白敲除的HEK293T细胞系,且初步研究发现该细胞系增殖能力下降。本研究有助于了解Fam49b在人类细胞中的功能,也为深入细致地研究Fam49b基因的作用和机制提供了有效的人类细胞模型。同时,我们首次发现人类Fam49b基因新的异构体Fam49b2,进一步完善了我们对人类Fam49b蛋白存在形式的认识,也有助于我们全面认识Fam49基因家族。另外,我们在U251细胞系中对CRISPR/Cas9技术的应用,不仅为后续构建基因敲除细胞系奠定基础,而且为CRISPR/Cas9技术在转染效率较低的细胞系中的应用提供重要的参考依据。