流行性感冒(Influenza)是流感病毒导致的强传染性疾病,一直是人类健康的重大威胁,对人类社会造成重大经济损失。世界范围内每年约有5%-15%的人口受季节性流感病毒感染,其中有25-50万人死亡。由于小分子药物及季节疫苗的局限性,寻求新的治疗及预防手段迫在眉睫。已报道的流感抗体的识别表位主要分为三种。类型一是以FI6v3,CR6261,F10,CR9114以及39.29等为代表,识别表位位于血球凝集素(HA)的融合亚结构域,包括HA1 N端和C端构成的上部和左侧,HA2 Helix A构成右侧,HA2融合肽C端构成下部。CR6261,F10只能中和Group1的流感病毒,而FI6v3,39.29及CR9114却既能中和Group1又能中和Group2的流感病毒。类型二以CR8020为代表,识别表位更加接近于HA的膜结合部位,包括Helix A序列前的βsheet及HA2上的融合肽,只能中和Group2的流感病毒。除此之外,类型三兼具以上两种类型抗体的识别表位,以MEDI8852及本实验室早期研发的3E1为代表。MEDI8852被报道能广谱性的中和Group1和Group2的流感病毒,3E1却只能中和Group1的流感病毒,但是在我们的研究中却发现MEDI8852不能结合个别H3N2 HA,这意味着针对H3N2更加广谱的、中和效果更好的流感抗体依然是未来重要的研究方向。除此之外,我们未能通过以上研究数据明确区分Group1及Group2流感病毒的识别表位的异同,即是否针对Group1及Group2流感病毒的抗体分别具有特各自特征性的识别表位?鉴于现有流感疫苗的短板,科学家们正努力研发广谱流感疫苗,因此新的抗体识别表位的发现也是重要的研究方向,将为广谱流感疫苗的设计提供新思路。为进一步阐述上述问题,我们启动本课题以研发一株Group2广谱流感抗体并寻找特征性识别表位。在本课题中,我们利用单细胞RT-PCR技术,从一名接种过三价季节性流感疫苗的志愿者体内成功分离一株Group2广谱中和抗体,12mAb。12mAb对全部Group2(H3/H4/H7/H10/H14/H15)亚型毒株HA具有较高亲和力,能广谱中和H3,H4及H7亚型的流感病毒。小鼠水平上的实验也证实12mAb对H3N2亚型流感病毒具有预防和治疗效果。机制研究表明12mAb是通过抑制低pH值诱导的HA的构象变化,进一步抑制宿主胞膜与病毒包膜的融合,从而抑制病毒入侵宿主细胞。为了从结构上探索抗原抗体的相互作用模式,我们通过冷冻电镜技术对12mAb Fab-H3N2 HA复合物进行结构解析。冷冻电镜结果显示,12mAb Fab的识别表位非常特殊,主要靶定于H3N2 HA的茎秆部区,包括Helix A的C端少数氨基酸,Helix A与Helix B之间的loop N端氨基酸序列及其附近的HA1上的部分氨基酸。目前,未曾报道有靶定到该表位的流感抗体。12mAb的CDR区深入到以上表位形成的沟槽中,我们认为这种结合方式更加紧密,预示着12mAb对H3N2 HA具有更高的亲和力。通过比较12mAb和已报道的广谱性及中和活性最好的流感病毒抗体MEDI8852,我们发现12mAb对不同年代流行的H3N2亚型流感病毒的结合及中和活性都要优于MEDI8852,尤其对近几年流行的H3N2流感病毒HA具有更好的结合活性,这与前期所述冷冻电镜结构数据比较一致。这为解决近几年频频爆发流行的H3N2病毒提供新的、更优的防控手段。冷冻电镜结构表明12mAb结合H3N2 HA的表位中包括Helix A与Helix B之间的loop区的N端氨基酸序列,该段序列在HA上是一段线性化序列。ELISA及Western Blot实验进一步证实此段序列的存在。结果表明,12mAb能结合线性化的H3N2 HA蛋白,而MEDI8852,CR8020等抗体均不能结合线性化的HA蛋白,表明12mAb识别H3N2 HA蛋白的一段线性表位,而其它抗体均是构象表位。这揭示出12mAb的与众不同。同时,我们通过截短表达实验找到12mAb结合H3N2 HA蛋白的主要序列,即H3N2 HA2 58-75位氨基酸。我们意外发现12mAb也能中和Group1的H1N1流感病毒。12mAb Fab主要靶定于H1N1 HA的Helix A上,这与FI6v3,CR6261等抗体的表位较为类似,却显著异于12mAb Fab对H3N2 HA的识别表位。目前未曾有流感抗体被报道在不同亚型HA的识别表位差异巨大,这代表一类新的抗体抗原相互作用模式。通过对12mAb的研究,我们明确了一个Group2异于Group1的识别表位。新的表位的发掘为流感疫苗的设计提供新的靶点与思路,同时提示我们广谱流感疫苗的设计不应只考虑所有亚型中HA的保守序列,还应考虑不同亚型HA的差异序列。