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植物细胞除细胞核外,叶绿体和线粒体也含有遗传物质DNA。随着基因组测序技术的不断改进,植物中已完成细胞核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组测序的物种数量在不断增加。通过生物信息分析法与生物实验相结合的方法来研究叶绿体基因组、线粒体基因组和细胞核基因组三者的结构和序列信息特征,可以揭示基因转移、物种的起源、进化的规律;此外还可为不同物种间的亲缘关系等方面的研究提供重要的理论依据。人工合成miRNA的干扰技术为研究细胞核和细胞器对基因表达调控的关系提供了有效的研究方法。
细胞色素b(cytochrome b,cob)是呼吸链中的重要成员之一。由于细胞色素b基因在拟南芥细胞核基因组与线粒体基因组中都存在,并且都是单拷贝的基因,利用RNA干扰技术下调核基因组中cob基因的表达,可以明确细胞核和线粒体对该基因表达调控的关系。
本研究利用人工合成miRNA的方法,构建了拟南芥细胞核基因组中cob基因干扰载体,并进行了拟南芥转化。取得的主要研究成果如下:
1)通过分析内源miRNA选择靶基因的参数,参考WMD3提供的候选序列,完成细胞色素b基因amiRNA分子设计。
2)根据所选择的前体完成引物设计。成功合成了重叠延伸所需模板和产物;运用重叠延伸PCR合成了amiRNA前体。测序结果表明,合成的amiRNA完全符合设计要求。
3)通过农杆菌花药浸染法将干扰载体转入拟南芥。
本文的研究结果,为探讨细胞核与线粒体对cob基因表达调控的关系与差异奠定了初步的基础。