pprI基因增强枯草芽孢杆菌抗逆性的试验研究

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奇球菌(Deinococcus radiodurans)是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的生物之一,同时其对过氧化氢、紫外线、干燥及一些DNA损伤试剂也有很强的抵抗性,一直倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视。该细菌能够在几十个小时内准确无误地修复几百个双链DNA碎片而不发生任何突变。现有研究表明,奇球菌在极端环境(电离辐射、紫外线、干燥)下的生存是保护、耐受和修复三方面协同作用的结果,是独特的新陈代谢转换途径和高效精确的DNA修复系统有效地协调了DNA的损伤修复。因此,研究其DNA修复及抗逆性相关的功能基因并阐明它们的生物学功能对进一步探索奇球菌的极端抗性与DNA修复机制具有重要的理论意义和应用价值。作为同源重组修复途径的重要修复基因,奇球菌pprI基因在DNA修复中起十分重要的作用。pprI能够显著地促进修复关键基因recA和pprA基因的表达,并且能够提高奇球菌过氧化氢酶的活性。  本实验主要围绕这一损伤修复开关基因展开,通过生物信息学的方法对 pprI进行同源性搜索及比对,在NCBI基因组数据库中没有找到显著同源的类似物,表明pprI可能是奇球菌所特有的基因。其中RecA修复酶及其同源物广泛的存在于原核和真核生物中,在 DNA损伤修复生物过程中发挥了十分重要的作用。利用BLAST比对奇球菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的recA基因,发现其具有较大相似性。因此我们推测将pprI基因在枯草芽孢杆菌中表达能够显著增强其DNA损伤修复机制。  为研究pprI基因在枯草芽孢杆菌中表达与细胞抗性之间的关系,通过PCR技术(聚合酶链式反应)复制扩增pprI基因,并通过穿梭质粒pRADZ3将pprI基因导入大肠杆菌中,在提取质粒最终转入枯草芽孢杆菌中稳定表达,并对照空白株进行了H2O2氧化压力和紫外线辐照下的存活率对比试验。  实验结果表明,导入pprI基因的枯草芽孢杆菌能显著增强菌体抗非离子辐射和抗氧化能力,对胞内 RecA修复酶等起正调控作用的开关。在对强氧化剂H2O2的抗性方面,在指数生长期内,B-1比对照株 B-2的存活率要高约10%左右;而稳定生长期,B-1比B-2的存活率要高约7%左右,且随氧化剂浓度增加而增加,说明 pprI基因在枯草芽孢杆菌中的稳定表达能够增强枯草芽孢杆菌细胞的抗氧化能力;在对紫外线辐射的抗性方面,枯草芽孢杆菌 B-1比对照菌株B-2的存活率高出两倍左右,显著增强了枯草芽孢杆菌抗非离子辐射的能力。由此可知pprI作为一个奇球菌独有的DNA修复开关基因在生物抗氧化与非电离辐射方面将具有普遍适用性。  当前放射性核污染对环境威胁日益严重,但普通微生物吸附剂存在着对辐射敏感,难以在长期核辐射下生存,而采用灭活菌体富集核素不能发挥长期作用,不适宜较低浓度铀矿冶地域的环境修复。目前奇球菌中可能存在着多个具有调控菌体抗性的独特基因(类似于pprI),这些功能基因又可以进一步应用于其他物种适应极端环境的基因改造领域,如增强其他物种的抗极端环境能力,还可以用于构建处理强氧化性化学污染的基因工程菌。这些改良的菌种将在低浓度铀矿冶地域环境特点的环境修复与资源回收中具有广阔的应用前景。
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