第一部分Caveolin-1在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性目的:乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤,全球每年新增乳腺癌患者超过120万,年死亡人数大约40万人,在我国的大中型城市,乳腺癌的发病率已经居妇女常见恶性肿瘤的第一位,乳腺癌预后较差,影响预后的诸多因素中乳腺癌的复发和远处转移是其预后不良的主要原因。HER-2也称为ErbB-2,是细胞来源的癌基因,位于染色体17q21,编码185KDa,是人类表皮生长因子受体家族的重要成员之一。HER-2蛋白由胞外区、亲脂性跨膜区和胞内酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTK)活性区三部分组成。有研究曾表明约30%乳腺癌患者发现HER-2过表达,且过表达常与乳腺癌的恶性度密切相关,预示患者预后不良。Caveolae家族是细胞膜凹陷形成的凹陷结构或微囊结构,在Caveolae蛋白的氨基酸结构中,N端的脚手架结构和可变的C端将其分为两个胞浆区,N端脚手架结构域由高度保守的氨基酸序列构成,Caveolae不仅主要通过此区域与胆固醇相互作用,而且还与各种信号分子的催化亚基结合,从而调节信号分子转导。Caveolin-1是此结构的标志性蛋白,近年来发现,Caveolin-1与肿瘤发生发展的多个方面,如肿瘤的增殖,发生,凋亡,迁移,耐药,转化等密切相关。在肿瘤发生和形成过程中,Caveolin-1通过调节多种信号传导分子和通路的活性,影响细胞的分化、增殖、迁移和凋亡等。目前人们对Caveolin-1作用的认识有一定的提高,可是对于Caveolin-1的抑癌及肿瘤生成作用及其作用机制仍存在很多争议。在包括乳腺癌在内一些特定的肿瘤中,Caveolin-1被认为发挥抑癌功能,得到了大多数人的认可。然而对Caveolin-1在乳腺癌调控多种相关信号分子通路,抑制乳腺癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡的具体机理,尚不十分清楚,成为人们进一步研究的热点,将成为肿瘤的诊断和治疗新目标。乳腺癌的发生发展过程是多条信号转导通路互相作用互相调节的复杂过程。在细胞的信号网络中,PI3K/Akt通路是一条典型的抗凋亡通路,其中Akt又称PKB,是该通路中一个重要的下游靶激酶。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路与肿瘤细胞增殖、浸润与转移密切相关。国内外研究提示,Cav-1在乳腺癌中的作用可能与上述两个信号通路有关。本研究拟应用免疫组化、体外培养细胞、质粒转染、免疫蛋白印迹等实验技术,探讨Caveolin-1参与乳腺癌的作用及其可能机制,从细胞、组织和分子水平综合分析Caveolin-1对HER-2磷酸化的调控,探讨Caveolin-1在Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路中的作用,为阐明乳腺癌发病机制提供新的实验数据,为有效预防和治疗乳腺癌提供新的靶点方法:1采用非生物素酶二步(PV)免疫组织化学方法,检测50例分化程度不同的浸润性乳腺癌组织及正常乳腺组织中Caveolin-l的表达,探讨其与乳腺癌临床生物学行为的关系及对预后的意义。2了解Caveolin-l和磷酸化人类表皮生长因子受体2(p-HER-2)的表达情况,以正常乳腺组织或乳腺良性增生为阴性对照。结果:1免疫组化检测Caveolin-1、HER-2、Ki-67在乳腺癌组织中的表达免疫组化结果显示,Caveolin-1的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞浆,呈现黄色-棕褐色颗粒。按判定标准Caveolin-1在正常乳腺组织中阳性表达的程度较强,在浸润性乳腺癌组织中表达较少,其表达率分别为80%和32%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Ki-67的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞核,HER-2的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞膜,呈现黄色-棕褐色颗粒。2Caveolin-1、HER-2、Ki-67的表达与乳腺癌临床病理因素的关系免疫组织化学结果显示,Caveolin-l在浸润性乳腺癌中的表达水平随淋巴结的转移而减低(P<0.05),随临床TNM分期而减低(P<0.05),各组间差异有统计学意义。Caveolin-l在浸润性乳腺癌中的表达水平与患者年龄、肿瘤直径、ER/PR、HER-2、Ki-67、及绝经前后等表达无关。3乳腺癌Caveolin-l与p-HER-2的表达关系免疫组化结果显示p-HER-2的阳性表达产物主要分布于乳腺上皮细胞的胞膜,呈现黄色-棕褐色颗粒。按判定标准p-HER-2在Caveolin-l低表达组中阳性表达的程度较强,在Caveolin-l高表达组中表达较少,其表达率分别为52.63%和16.67%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4Caveolin-1的表达与乳腺癌预后的相关性分析免疫组化结果显示,在Caveolin-1表达阳性的患者中,5年生存率高于Caveoiin-1表达阴性的患者组。采用Kapian-Meier法进行生存分析,结果显示Caveolin-1表达阳性的病例预后明显好于Caveolin-1表达阴性的病例。第二部分Caveolin-1影响乳腺癌细胞生物学行为的的分子机制方法:1细胞复苏和培养将MDA-MB-453细胞冻存管从液氮中取出,融化后用含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640培养基在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。2质粒提取用QIAGEN质粒提取试剂盒,分别提取pcDNA3.1-Cav1和pcDNA3.1阴性对照质粒,构建稳定转染细胞。设置MDA-MB-453组、pcDNA3.1-Cav1(Cav-1)转染组和pcDNA3.1转染对照组,加嘌呤霉素进行抗性筛选,未转染组细胞全部死亡。稳定转染pcDNA3.1-Cav1质粒的MDA-MB-453细胞即MDA-MB-453/Cav-1,稳定转染阴性对照质粒的MDA-MB-453细胞即MDA-MB-453/pcDNA3.1。3Westernblot和实时定量PCR验证过表达Caveolin-1效果培养MDA-MB-453、MDA-MB-453/Cav-1和MDA-MB-453/pcDNA3.1细胞,待细胞长满至培养皿的80%左右,用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4小时,收集细胞提取总蛋白,采用免疫印迹(Western-blot)法测定不同乳腺癌细胞中Caveolin-1蛋白的表达情况。将MDA-MB-453/Cav-1细胞MDA-MB-453/pcDNA3.1细胞和MDA-MB-453细胞分别接种于35mm培养皿中,利用实时定量PCR检测稳定转染细胞中Caveolin-1mRNA的表达水平。4MTT法观察稳定转染细胞的增殖情况培养MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1细胞,用MTT法检测细胞增殖水平,每种细胞设四组分别予EGF(0nM、4nM、20nM、100nM)刺激细胞24小时后,用MTT比色分析法检测分组乳腺癌细胞的增殖水平,记录并分析结果。5采用划痕修复实验观察稳定细胞的迁移能力培养MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1细胞,接种于24孔板,将两种细胞分别分为无EGF刺激组和20nMEGF刺激组,利用显微镜下观察并拍照0h、24h、48h、72h、96h后观察划痕愈合宽度的变化,计算细胞迁移率。6Transwellcellinvasionassay检测稳定转染细胞的侵袭能力培养MDA-MB-453/pcDNA3.1、MDA-MB-453/Cav-1细胞,在无血清的1640培基饥饿4h。利用胶均匀铺在Transwell的小室,并常规HE染色,光镜下拍照,统计穿膜细胞数。采用Transwell法检测细胞的侵袭能力,了解不同乳腺癌细胞的侵袭能力。结果:1乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的Caveolin-1表达情况1.1Westernblot检测转染后细胞Caveolin-1的蛋白表达水平Westernblot检测转染后MDA-MB-453细胞Caveolin-1的蛋白水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平分别为0.02±0.00,0.02±0.00,0.60±0.03,MDAMB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平明显高于对照组,有统计学意义(P<0.01)。1.2实时定量PCR检测Caveolin-1的mRNA的表达水平实时定量PCR检测MDA-MB-453稳定转染细胞Caveolin-1mRNA的表达水平。MDA-MB-453、MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的mRNA表达水平分别为1.00±0.00、1.12±0.05、7.09±0.43,MDA-MB-453/Cav-1细胞Caveolin-1的表达水平明显高于对照组(1.00),差异具有显著统计学意义(P<0.01)。2乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的增殖情况将乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453接种于96孔板,分别经0nM、4nM、20nM、100nM刺激后,MTT法检测各孔的OD值进行统计分析,MDA-MB-453/Cav-1组的OD值为0.80±0.07,0.86±0.03,0.93±0.03,1.00±0.03,均明显低于对照组的OD值0.93±0.05,1.02±0.04,1.12±0.06,1.32±0.09,有显著统计学意义(P<0.01)。3乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的迁移情况利用相应软件测量划痕宽度,计算细胞迁移率:细胞迁移率=(划痕初始宽度-划痕目前宽度)/2/划痕初始宽度×100%。无EGF刺激时,MDA-MB-453/Cav-1细胞在24h、48h、72h、96h的迁移率(2.31±0.55,9.04±2.14,16.08±2.54,21.93±2.60)各时间点均明显低于对照组(5.21±0.42,12.13±0.38,23.56±1.99,35.04±2.47),均具有统计学意义(P<0.05)。给予20nMEGF刺激后,MDA-MB-453/Cav-1细胞的迁移率(4.80±0.48,11.90±0.98,19.50±2.53,27.71±2.06)各时间点均明显高于无EGF刺激组(2.31±0.55,9.04±2.14,16.08±2.54,21.93±2.60),均具有统计学意义(P<0.01)。4乳腺癌稳定转染细胞MDA-MB-453的侵袭情况采用Transwell法检测细胞的侵袭能力,MDA-MB-453/Cav-1组穿膜细胞数(16±2)明显低于对照组(31±3),有统计学意义(P<0.01)。第三部分Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2活化的影响方法:Westernblot检测稳定转染细胞的Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin的蛋白表达情况。实验分为两组:pcDNA3.1-Cav1转染组和pcDNA3.1转染对照组,培养并用嘌呤霉素筛选乳腺癌稳定转染MDA-MB-453/pcDNA3.1和MDA-MB-453/Cav-1细胞,每组分别于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集细胞,提取蛋白,Western-blot检测各时间点Caveolin-1、4G10、HER-2、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK、β-actin蛋白的表达情况,统计分析。结果:过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞HER-2活化的影响统计结果显示,pcDNA3.1-Cav1组各时间点Caveolin-1的表达水平(1.12±0.03,1.08±0.06,1.13±0.06,1.11±0.04)均明显高于对照组(0.05±0.01,0.04±0.01,0.04±0.00,0.04±0.01)的表达水平,均有统计学意义(P<0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化HER-2分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平(0.98±0.04,0.50±0.03,0.20±0.01)均明显低于对照组(1.25±0.03,1.07±0.03,0.50±0.02)的表达水平,均有统计学意义(P<0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化Akt分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平(0.50±0.01,0.67±0.03,0.42±0.01)均明显低于对照组(0.85±0.05,1.20±0.08,0.82±0.04)的表达水平,均有统计学意义(P<0.01);pcDNA3.1-Cav1组磷酸化ERK分别于EGF刺激5min、10min、30min后的表达水平(0.58±0.01,0.80±0.03,0.45±0.01)均明显低于对照组(0.93±0.02,1.10±0.06,0.72±0.05)的表达水平,均有统计学意义(P<0.01)。结论:1Caveolin-1在正常乳腺上皮细胞高表达;Caveolin-1在浸润性乳腺癌组织中的表达较低。2Caveolin-1的高表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,表明Caveolin-1对乳腺癌细胞的增殖和转移具有抑制作用。3Cav-1通过调控乳腺癌细胞HER-2磷酸化水平,影响Ras/Raf/MAPK及PI3K/Akt信号转导通路的活化,进而影响浸润性乳腺癌的恶性程度和预后,以及乳腺癌细胞一系列生物学行为。