1研究背景LPS为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,细菌入血后在血液中释放出LPS会引起急性全身免疫系统反应,其中急性心肌炎症反应使得心脏收缩力下降、心率加快、射血分数减少,严重时会导致心功能衰竭甚至死亡。肉桂是我国中医临床常用中药,在众多方剂中都有应用,其抗菌护心的作用更是受到国内外众多学者的关注。但由于肉桂所含成分复杂,难以阐明其作用机制及作用靶点,这使得肉桂的开发利用受到了一定程度的阻碍。随着天然药物化学的发展,使用单一药材的主要成分去替代药材本身的理论逐渐被人们所接受。肉桂的提取挥发油中主要成分为桂皮醛(别名肉桂醛),同样表现出显著的抗菌和心脏保护作用,运用现代中药药理学理论我们便能详细透彻得阐明其在体内的作用机制。由于桂皮醛水溶性不好,且在体内具体的代谢参数尚不确切,在分析桂皮醛的药理作用之前,桂皮醛的药代动力学研究仍需深入探讨。为了更加高效地利用我国传统中药,使我国传统中医药中的常用中药肉桂能够得到更广泛的应用和承认。本课题探究了桂皮醛及其水溶性乳剂的药代动力学参数、对LPS所致心肌损伤的保护作用并阐明其作用机制,为桂皮醛的新药研制提供实验依据。2方法2.1桂皮醛在大鼠体内药代动力学及组织分布特性:建立GC-MS检测桂皮醛在大鼠血液及各组织中含量的方法。色谱柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25μm;Agilent Technologies)毛细管色谱柱。柱温:起始柱温50°C,保留1 min,以10°C/min升温至160°C,保留1 min;再以20°C/min升至280°C,保留1 min。载气:氦气,流速1.0 m L/min。质谱条件:传输线、离子源温度均为250°C,离子源为EI,电离能为70 e V,SIM特征离子为131 m/z,105 m/z和92 m/z。用已建立的方法对桂皮醛在体内的代谢及分布情况进行全面系统的分析。2.2桂皮醛亚微乳在大鼠体内药代动力学及组织分布特性:为改善桂皮醛的水溶性、药代动力学及其组织分布特性,我们采用高压匀化方式制备了桂皮醛微乳制剂。使用动态光散射仪及电子显微镜评价了桂皮醛亚微乳粒径的均一性、ζ电位及微乳显微形态,并对其长期稳定性做了初步的评价。在成功制备了稳定均一的桂皮醛亚微乳后,我们使用2.1中方法检测了桂皮醛亚微乳在大鼠体内的代谢及组织分布情况,并与桂皮醛原药所得药代动力学参数进行比较。2.3桂皮醛对脂多糖(LPS)诱发大鼠心脏损伤的保护作用:实验采用LPS诱导大鼠心肌炎模型,设正常组、模型组、溶剂对照组、低剂量、中剂量、高剂量(30、60、90 mg/kg)桂皮醛治疗组共6组。完成以下指标的检测:(1)取心脏相同部位用于石蜡切片包埋,并进行H&E染色观察心肌组织病理变化;(2)采用ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量;(3)对各组大鼠进行心脏超声检测心脏收缩分数(Fraction shorting),评价给药前后心脏功能;(4)应用免疫组化和Western Blot方法对大鼠心肌组织中的LC3和TLR4蛋白表达进行检测;(5)取心脏相同部位采用Western Blot检测MAPK通路中关键蛋白JNK、ERK和p38及其磷酸化的表达。籍此,揭示桂皮醛对LPS诱发心肌损伤的作用及其分子机制。2.4桂皮醛对LPS诱发心肌细胞损伤的保护作用:体外培养心肌原代细胞,并于分离培养36 h后用于实验。设正常组、模型组、低剂量、中剂量、高剂量(0.01、0.1、1μM)桂皮醛治疗组共5组,实验预给予桂皮醛2 h,而后给予LPS(5μg/m L)刺激4 h。完成以下指标的检测:(1)采用激光共聚焦及Western Blot技术检测ROS及相关炎症蛋白在心肌细胞中的表达;(2)采用透射电镜和激光共聚焦观察自噬小体在心肌细胞中的表达;(3)检测LPS刺激后细胞凋亡的情况;(4)采用Western Blot及si RNA技术检测桂皮醛对TLR4-NOX4信号通路的影响。(5)利用分子对接技术(molecular docking)拟合桂皮醛作用心肌细胞的靶点,以期阐明其作用机制。3结果3.1桂皮醛在大鼠体内血浆药代动力学及组织分布特性:实验成功建立GC-MS测定桂皮醛含量的方法。桂皮醛在血浆中测定的线性范围为20~2000 ng/m L(r2≥0.999);最低定量限和检测限分别为20 ng/m L与5 ng/m L;日间与日内精密度分别小于10.4%与12.2%。根据上述方法测定桂皮醛在血液中浓度,计算口服和静脉注射后,桂皮醛在血浆中半衰期为6.7±1.5 h和3.3±2.9 h。桂皮醛在各组织中测定的线性范围为20~2000 ng/m L(r2≥0.999),日间与日内精密度均小于11.3%;实验发现桂皮醛能透过血脑屏障且在脾脏中的浓度高于心、肝、肺、肾和脑组织。3.2桂皮醛亚微乳在大鼠体内血浆药代动力学及组织分布特性:桂皮醛与大豆油、卵磷脂和甘油制成亚微乳。该亚微乳平均粒径、ζ电位及包封率分别为130±5.92nm、-25.7±6.00 m V与99.5±0.25%。静脉注射20 mg/kg桂皮醛亚微乳后,血浆中桂皮醛最大浓度由单体的547±142 ng/m L提升至1052±184 ng/m L。组织分布特性表现为肝、肾及脾脏中浓度有所提升,其它组织未见明显增多。3.3桂皮醛对LPS诱发大鼠心脏损伤的保护作用:桂皮醛能显著改善LPS刺激后心脏功能。在LPS刺激后,心脏H&E染色切片显示,心肌组织间隙炎性浸润增多,肌纤维呈不连续或坏死状;ELISA结果显示,大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6在LPS刺激后显著升高;心脏超声心动图结果显示,心脏收缩分数FS值在LPS刺激后下降;免疫组化和Western Blot结果显示,炎性与自噬相关蛋白TLR4与LC3均有一定程度升高;MAPK通路中关键蛋白JNK、ERK和p38均大量发生磷酸化。在给予桂皮醛治疗组发现,以上现象均发生不同程度好转。3.4桂皮醛对LPS诱发心肌细胞损伤的保护作用:桂皮醛通过调节TLR4-NOX4信号通路,调控心肌细胞自噬从而对心肌细胞起到保护作用。与模型组相比较,桂皮醛能显著降低ROS在心肌细胞中的含量,并下调炎症相关JNK蛋白至正常水平。在透射电镜及激光共聚焦观察中,模型组自噬小体显著增多,给药组自噬小体则有所减少。TLR4 si RNA及NOX4 si RNA显示出桂皮醛可作用于TLR4-NOX4信号通路并对自噬及凋亡起到了调控作用。molecular docking结果拟合出桂皮醛对TLR4及NOX4都具有较强的亲和力,并发挥直接的作用。4结论桂皮醛在大鼠体内药动力学特征符合二室模型,即药物首先在中央室形成动态平衡,而后分布到周边室达到动态平衡的房室模型;桂皮醛原药及亚微乳主要分布于脾、肝、肾中,桂皮醛在制成亚微乳后血液及组织中桂皮醛浓度都显著提高;桂皮醛抗心肌炎的作用机制与TLR4-NOX4信号通路相关,桂皮醛通过调节TLR4-NOX4实现对LPS造成心肌损伤的保护作用。本研究首次阐述了桂皮醛的药代动力学基本参数及药效学基本原理,为今后的新药研发提供了重要依据。