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宫腔粘连又名Asherman综合征,是指宫腔前后壁之间形成的纤维粘连带。它是宫腔操作手术后例如人工流产、诊断性刮宫,粘膜下肌瘤切除术等的常见并发症,其最为严重的后果是继发不孕。目前临床上已有的预防措施包括:(1)术后口服雌激素促进子宫内膜修复;(2)术后放置宫腔内节育器;(3)宫腔内安置气囊尿管;(4)宫腔内注射透明质酸(hyaluronic acid,HA)凝胶。后三种方法运用了其物理屏障的作用使子宫内膜的前后壁分隔开,但均存在一定弊端。宫内节育器以及尿管的安置需要再次手术取出,而透明质酸凝胶在宫腔内滞留时间较短,难以起到长时间的隔离作用。本实验拟通过制备含透明质酸的生物可降解膜,一方面生物可吸收膜可以起到更为持久的宫腔隔离的作用,并且逐步降解不需要再次手术取出;另一方面生物可吸收膜所载的HA能起到干预子宫内膜纤维化,从而起到预防宫腔粘连的作用。本实验首先以子宫内膜过度纤维化作为宫腔粘连的发病基础,对宫腔粘连患者以及动物模型进行了发病机制的初步研究。然后在宫腔粘连动物模型上对透明质酸预防宫腔粘连及其可能作用机制进行了初步探讨。为了保持透明质酸在宫腔内能够起到更为持久的作用,制备了载HA的PLGA膜,对该膜的机械性能、药物释放、细胞毒性等方面进行了研究。最后在动物模型中验证了载HA的PLGA膜对宫腔粘连动物模型子宫内膜纤维化的抑制作用。基于上述研究我们认为载HA的PLGA膜具有预防宫腔粘连的潜在价值,对其特性的进一步研究将为其临床运用提供更多的理论基础。第一部分宫腔粘连患者的子宫内膜纤维化程度研究目的:观察宫腔粘连患者子宫内膜纤维化程度以研究纤维化是否参与宫腔粘连的形成。方法:运用Masson染色的方法比较宫腔粘连患者与正常妇女子宫内膜纤维化程度。运用IHC的方法比较宫腔粘连患者与正常妇女子宫内膜纤维化相关蛋白的表达差异。结果:宫腔粘连组子宫内膜的纤维化程度明显高于正常妇女组(P<0.05)。宫腔粘连组子宫内膜的纤维化相关蛋白TGFβ1,CTGF,CoⅠ,CoⅢ的表达明显高于正常妇女组(P<0.05)。结论:子宫内膜的纤维化参与了宫腔粘连的发生。第二部分宫腔粘连动物模型的建立及鉴定目的:建立宫腔粘连的雌性昆明小鼠动物模型并对其进行鉴定,为后续的HA/PLGA膜预防宫腔粘连实验提供动物模型。方法:将昆明雌性小鼠分为假手术组和损伤组,假手术组仅进行开关腹的手术,损伤组进行开腹后子宫内膜的搔刮和LPS的注射以造成内膜的损伤。运用Masson染色的方法对假手术组和损伤组子宫内膜的纤维化程度进行比较。运用IHC和WB方法对昆明雌性小鼠假手术组和损伤组的子宫内膜纤维化相关蛋白进行检测。结果:损伤组子宫内膜的纤维化程度明显高于假手术组(P<0.05),损伤组子宫内膜的纤维化相关蛋白表达明显高于假手术组(P<0.05)。结论:经过宫腔搔刮和宫腔注射LPS的方法能够建立昆明雌性小鼠的宫腔粘连动物模型,为后续实验提供了基础。第三部分透明质酸预防宫腔粘连的机制研究目的:探讨不同分子量HA对宫腔粘连小鼠动物模型的子宫内膜纤维化程度的影响及其可能的作用机制。方法:在第二部分建立的小鼠宫腔粘连动物模型基础上,将动物实验分为对照组、HMW-HA组和LMW-HA组,后两组于宫腔内注射大分子及小分子HA。运用IHC和WB的方法对各组子宫内膜纤维化程度以及纤维化相关蛋白进行检测。另原代培养子宫内膜间质细胞,并分别加入PBS,TGFβ1,TGFβ1+HA,TGFβ1+HA+抗CD44阻断抗体,并运用Western Blot和q PCR的方法检测各组细胞中纤维化相关蛋白的表达。结果:HMW-HA组子宫内膜的纤维化程度明显小于对照组(P<0.05),而LMW-HA组子宫内膜纤维化程度与对照组相比无明显差异(P>0.05)。HMW-HA组子宫内膜的纤维化相关蛋白的表达明显低于对照组(P<0.05),而LMW-HA组子宫内膜纤维化相关蛋白的表达与对照组相比未见明显差异(P>0.05)。在子宫内膜间质细胞的实验中,TGFβ1组的纤维化相关蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),TGFβ1+HA组的纤维化相关蛋白表达明显低于TGFβ1组(P<0.05),TGFβ1+HA+Anti-CD44 Antibody组纤维化相关蛋白表达明显高于TGFβ1+HA组(P<0.05)。各组细胞中smad2蛋白的表达量并未发生明显变化,而TGFβ1组的smad2蛋白磷酸化水平高于对照组,TGFβ1+HA组smad2蛋白磷酸化水平低于TGFβ1组,TGFβ1+HA+Anti-CD44 Antibody组smad2蛋白磷酸化水平高于TGFβ1+HA组。结论:HMW-HA具有抑制子宫内膜纤维化的作用,而LMW-HA没有类似作用。HA与子宫内膜间质细胞CD44的结合,抑制了TGFβ1/Smad2通路,使smad2蛋白磷酸化水平下降,从而抑制了纤维化相关蛋白的表达。第四部分HA/PLGA膜的制备及性质鉴定目的:制备HA/PLGA膜,并对膜的表面特征、体内外降解情况、抗变形能力、药物释放能力、细胞毒性进行检测。方法:根据文献报道的方法制备PLGA膜及HA/PLGA膜。运用扫描电镜对PLGA膜的表面特征进行观察。将PLGA膜浸泡于模拟宫腔液中及放置入子宫内进行体内外降解实验。运用拉伸实验测量不同单体比例PLGA的抗变形能力,并在离体子宫标本上进行HA/PLGA膜通过宫颈管的变形能力观察。运用体外药物释放系统和硫酸咔唑法对HA/PLGA膜中HA的体外释放能力进行检测。运用细胞毒性体外实验和MTT法对HA/PLGA膜浸提液的毒性进行检测。结果:不同单位比例的PLGA膜的表面特征无明显差异。不同单体比例的PLGA体外降解时间不同,PLGA(50:50)的降解速度最快,在4周时绝大部分发生降解,PLGA(90:10)降解速度最慢,在12周时大部分未降解,PLGA(75:25)降解速度介于前两者之间。体内降解实验发现PLGA(75:25)、PLGA(90:10)、HA/PLGA在宫腔内滞留时间均能达到7天以上。随着PLGA中LA比例的增加,其弹性模量增加,抗变形能力减弱。HA/PLGA弹性模量明显降解,具有良好的抗变形能力,通过宫颈管后未发生明显的膜碎裂。透明质酸能够在体外进行缓慢释放,于第4周时HA释放量达到64.51%。HA/PLGA膜浸提液对子宫内膜细胞的毒性作用与阴性对照组相当,明显低于阳性对照组(P<0.05)。结论:不同单位比例的PLGA膜的表面特征无明显差异,选择PLGA(75:25)作为HA的载体。HA/PLGA膜具有良好的抗变形能力,能够通过宫颈管而不发生膜碎裂。透明质酸能够在体外进行缓慢释放。HA/PLGA膜浸提液对子宫内膜细胞毒性较小。第五部分HA/PLGA膜预防宫腔粘连作用的研究目的:观察HA/PLGA膜对宫腔粘连动物模型子宫内膜纤维化水平的影响。方法:运用Masson染色的方法对对照组、PLGA组、HA/PLGA组子宫内膜纤维化程度进行检测。用IHC和Western Blot的方法检测对照组、PLGA组、HA/PLGA组子宫内膜纤维化相关蛋白水平的表达进行检测。结果:HA/PLGA组子宫内膜纤维化水平明显低于对照组(P<0.05),HA/PLGA组子宫内膜纤维化相关蛋白表达水平低于对照组。而PLGA组子宫内膜纤维化程度和子宫内膜相关蛋白的表达水平与对照组相比无明显差异。结论:HA/PLGA膜具有抑制子宫内膜纤维化的作用。