精原干细胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是成年雄性动物曲细精管中唯一能进行终生自我更新的一类二倍体永生细胞群。精原干细胞首先能够减数分裂后形成单倍体的生殖细胞，并且具有类似胚胎干细胞的发育多潜能性。对精原干细胞进行基因修饰后，能将外源基因稳定遗传到后代基因组中，所以精原干细胞是进行体外操作理想的干细胞群体。随着小鼠精原干细胞培养和移植研究的不断完善，为各种哺乳动物及人类精原干细胞培养体系的建立和移植提供了新的思路和技术路线。大动物精原干细胞的体外长期培养尚未取得突破性进展，目前为止，除了牛精原干细胞曾培养一个月的报道之外，在其他动物的精原干细胞建系和长期培养成功的报道。本实验以绵羊为研究对象，比较了不同月龄羔羊睾丸曲细精管中的精原干细胞的动态变化，在此基础上选择适龄绵羊，通过两步酶消化分离并差异贴壁法富集精原干细胞，对精原干细胞的短期和长期培养进行了初步研究。　　 一.绵羊精原干细胞增殖和分化相关基因的克隆测序　　 本研究对与绵羊睾丸细胞自我更新、增殖和分化相关的基因，即PLZF、SCF、c-Kit、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4以及管家基因GAPDH和18S等进行了克隆、测序。结果显示：SCF、c-Kit、18S和GAPDH等4个基因与已发表(Pubmed)的绵羊相关基因序列有同源性；而PLZF、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4等5个基因未见有相关的序列，但与牛的相关基因有高度同源性。　　 二.绵羊曲细精管中精原干细胞动态变化的观察　　 本研究，将1-10个月龄的羔羊划分为四个发育期，即一期(1-2个月龄)、二期(3-4个月龄)、三期(5-6个月龄)和四期(9-10个月龄)，以PLZF、PGP9.5、VASA和Vimentin分别作为精原干细胞(或性原细胞)、A型精原细胞、生殖细胞和支持细胞的标志基因，观察曲细精管中精原干细胞的动态变化。　　 1.不同月龄羔羊睾丸曲细精管中PLZF、PGP9.5、VASA和Vimentin的表达　　 免疫组织化学实验显示，PLZF在一期的性原细胞的细胞核中表达，到二期在位于靠近基膜的部分精原细胞的核中表达，三期和四期，仅在靠基膜的部分精原细胞中表达；PGP9.5通常在一期的曲细精管中心区的细胞质中有表达，之后逐渐从中心区迁移到基膜附近；VASA在一期的性原细胞的细胞质中表达，到二期在位于靠近基膜的所有精原细胞和刚刚发生的精母细胞的细胞质中都均有表达，发育到三、四期后，在精原细胞、精母细胞、长形精子细胞和精子中都均有表达，而且VASA阳性细胞数量急剧上升；Vimentin主要表达在支持细胞的核周围，强度跟着羔羊月龄的增加而增强，在生殖细胞中不表达，小部分间质细胞和血管壁上呈微着色。　　 根据以上情况对曲细精管中的不同类型细胞做了统计，结果是一期主要由支持细胞组成(93％)，性原细胞约占6.4％；到二期支持细胞下降为64％，精原干细胞增加至12.2％，同时观察到A型精原细胞，约占19.8％；在三期和四期，生殖细胞含量明显高于一二期(P<0.05)，精原干细胞下降至4.6％和3.1％，同时支持细胞的含量也明显的减少，分别为37.3％和17.9％，(P<0.05)。以上结果表明，前两个发育期即4个月龄以下的羔羊睾丸曲细精管中精原干细胞含量相对多一些，便于分离提纯。　　 2.不同月龄羔羊睾丸曲细精管中PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PIZF-VASA荧光双染色结果　　 PLZF-PGP9.5荧光双染色显示：PLZF的阳性反应主要发生在性原细胞和精原细胞的细胞核内，同时这些细胞的细胞质对PGP9.5染色呈阳性；在一期，绝大多数PGP9.5阳性细胞同时呈PLZF阳性，到了二期，部分PGP9.5阳性细胞中PLZF染色呈阴性，三期和四期，PGP9.5-PLZF双阳性的细胞数目逐渐减少。VASA-Vimentim双染色结果显示：VASA染色发生在细胞质内，而Vimentin染色发生在核周围；四个发育期的VASA阳性细胞均呈Vimentin阴性，随着月龄的增长VASA阳性细胞数量急剧增多，Vimentin阳性细胞的数目则相对稳定。PGP9.5-Vimentin染色结果显示：PGP9.5阳性细胞与Vimentin阳性细胞不吻合，PGP9.5阳性细胞成圆形或椭圆形，而Vimentin阳性细胞的形态则不规则。PLZF-VASA染色结果显示：在一期的性原细胞中PLZF和VASA都呈阳性，到二期，部分VASA阳性细胞对PLZF呈阴性；三期和四期，VASA阳性细胞的数量急剧上升，而PLZF-VASA双阳性的细胞数目明显减少。以上结果与免疫组织化学处理结果基本一致，羔羊曲细精管内的生殖细胞在两个月龄之前尚处于性原细胞阶段，之后逐渐分化为A型精原细胞和其它向终端分化的细胞，这表明最佳获得精原干细胞的时期是两个月龄以前。　　 三.绵羊精原干细胞的分离与纯化　　 本研究利用两步酶消化法从发育一到二期羔羊睾丸组织中分离细胞。结果是，在一期从1克睾丸组织中可分离出19.2±4.3×107细胞，但到了二期分离的细胞数明显减少，减至8.0±0.6×107细胞。　　 分离后的细胞通过差异贴壁法进行富集，然后对刚分离后收集的细胞(未处理组)、经过2个小时纯化得到的细胞(2小时处理组)和18小时纯化处理得到的细胞(18小时处理组)分别进行PLZF、VASA、Vimentin染色处理和PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PLZF-VASA荧光双染色，其结果是：①在一期PLZF阳性细胞的比例在2小时处理组和18小时处理组分别为42.9±6.2％和75.1±4.0％，显著高于未处理组的7.8±1.3％(P<0.05)；在二期，前两个处理组分别为18.6±3.0和28.2±3.3％，仍显著高于未处理组的3.1±0.6％(P<0.05)；涂片染色还显示，PLZF阳性细胞呈现出较强和较弱两种细胞类型，强阳性细胞的体积较小，弱阳性细胞的体积大；强阳性细胞比例在2小时后处理组明显增加，但与18小时处理组没有显著差异。②VASA阳性细胞的比例在一、二期2小时处理组和18小时处理组均显著高于未处理组(P<0.05)，而Vimentin阳性细胞的比例则显著低于未处理组(P<0.05)。③PLZF-PGP9.5双阳性细胞比例在一期18小时处理组达75％以上。以上结果表明，在一期(2个月龄以前)睾丸组织中得到的性原细胞经分离、纯化后可以用于体外培养研究。　　 四.绵羊精原干细胞的体外培养　　 1.绵羊精原干细胞的体外短期培养和免疫细胞化学、荧光染色检测　　 以Ⅰ型和Ⅱ型两种睾丸混合细胞分别作为饲养层细胞，用DMEM/F12+10％FBS基础培养液对纯化后的性原细胞进行体外培养。然后利用免疫细胞化学、荧光染色技术鉴定精原干细胞。结果显示，在两种饲养层上，均可观察到如下现象：性原细胞在培养到1-2天开始贴壁，3-4天后分裂增殖。先出现2-32细胞的链状细胞或小细胞团，一周左右后形成细胞团。细胞团的分布均匀，大小比较一致，看不到细胞间隙，细胞增殖成融合状，但Ⅰ型饲养层上的细胞团数目显著高于Ⅱ型饲养层上的细胞团数目。在培养10天左右时，长出较大的细胞团，形态为圆形鸟巢状集落，中间隆起；体积较小时颜色较透明，增大后逐渐变得黯淡，边缘的细胞呈放射状生长；Ⅰ型饲养层上的细胞团的活力明显大于Ⅱ型饲养层上的细胞团。　　 免疫细胞化学结果显示，培养十四天后的精原干细胞团和链状细胞都显示较强的PLZF阳性，而饲养层不着色。通过机械法分离精原干细胞团，然后进行短暂胰酶消化处理，再做细胞涂片进行免疫细胞化学和荧光染色。结果显示，在Ⅰ型饲养层的处理组，30％的细胞出现PLZF阳性；但在Ⅱ型饲养层的处理组，阳性细胞不到10％。在两种处理组中，VASA阳性细胞的比例都在60％左右，说明经短期培养后部分细胞可能开始分化。是否血清中的不明成分导致精原干细胞分化，有待进一步探索。　　 PLZF-VASA荧光双染色结果显示，精原干细胞团里包含PLZF和VASA双阳性的细胞，而在VASA-Vimentin双染色中，几乎看不到Vimentin阳性细胞，绝大多数为VASA阳性细胞，表明精原干细胞团可能不包含支持细胞和间质细胞。　　 2.绵羊精原干细胞的无饲养层长期培养和RT-PCR检测　　 通过降低血清浓度，同时添加B27和生长因子GDNF、LIF和βFGF，在铺有0.2％明胶的35mm培养皿里无饲养层长期培养绵羊精原干细胞。其结果3天后出现4到8细胞的链状细胞，第5天后链状细胞的数量急剧上升，出现32个细胞的链状细胞，但绝大多数细胞不贴壁增长。传代后大部分细胞开始贴壁，而且干细胞团数目随着传代次数增多而减少。RT-PCR检测发现，培养2周和4周后的细胞均表达精原干细胞标记PLZF、GFRα1，也能检测到A-型精原细胞的标记PGP9.5；但精原细胞分化的标记c-Kit在两周后表达微弱，到4周后几乎检测不到；生殖细胞的标记物VASA在两周后微弱表达，到4周后开始检测不到，其具体原因还不清楚，说明本研究中采用的绵羊精原干细胞长期培养体系尚需进一步优化。