论文部分内容阅读
生物大分子的核质转运是由受体importinβ蛋白家族成员介导完成的。在研究胚胎肺发育的过程中，发现了一个新的importinβ家族成员，命名为importin13.Importin13是目前所知的哺乳动物细胞中唯一具有双向转运功能的受体蛋白。另外研究还发现Imp13的表达受到糖皮质激素和机体发育期的双重调控，是目前所知的唯一一个受到双重表达调控的核质转运受体。
通过Northern blot分析发现，importin13在胚胎肺、脑及心脏都有大量的表达，为了了解imp13在心脏中的功能，我们利用酵母双杂交系统在人的心脏cDNA文库中筛选可与importin13相互作用的蛋白质，筛选到myopodin蛋白(359-698aa)。据文献报道myopodin蛋白可能具有以下功能：1.与肌动蛋白结合形成结构蛋白；2.核质穿梭蛋白，参与信号转导；3.表达量的高低和核质分布与前列腺癌及膀胱癌的恶化有关，细胞核中Myopodin含量增加可以抑制前列腺癌及膀胱癌的转移和扩散。
虽然已有文献报道importinα和14-3-3蛋白介导myopodin蛋白的入核。但importinα本身不能单独介导蛋白质的入核，而是作为imponinβ家族成员的接头蛋白。因此有关myopodin如何进行核质转运的分子机理还未弄清，而myopodin在核质之间的转移与其抑制肿瘤的功能有很大关系。本论文研究了myopodin与importin13间的相互作用，并且探讨了由importin13介导的myopodin蛋白质的核质转运机制。
本研究发现：
1.以importin13为诱饵蛋白在人心脏文库中通过酵母双杂交筛选到与之相互作用的myopodin蛋白，并通过RT-PCR从中国人骨骼肌中获得MYOPODIN全长ORF基因。
2.通过GST pull down和免疫共沉淀实验验证了importin13与myopodin之间的相互作用。
3.研究内源myopodin及其不同片段myopodin与EYFP融合蛋白(F-MPD，N-MPD，C-MPD，M-MPD)以及敲除NLS的myopodin突变体在不同细胞中的定位，发现位于N-端的NLS1无核定位功能，而C-端的NLS2有较强的核定位功能，但还存在其他入核信号。
4.异核体细胞融合证明myopodin是核质穿梭蛋白。
5.Importinl3是myopodin蛋白的入核转运受体：(1)myopodin的N端不能与importin13相互作用，间接推测importin13识别myopodin的C端；(2)突变了NLS1和NLS2的myopodin依然能与importin13相互作用，说明还存在其他入核信号；(3)Ran结合实验证明了importin13是myopodin的入核转运受体；(4)过量表达的C-importin13阻止内源myopodin的入核；(5)importin7，importin8，importinα2，importinβ2均不能与myopodin相互作用或作用力很弱，说明importin13是myopodin的特异转运受体。